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sqhnsd

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象已有5人参与

本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质
柱子：C8 孔径 300 A
A液： 98% 水 2% 乙腈 0.1% TFA
B液： 90% 乙腈 10%水 0.1% TFA
样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（楼下有图）
A-B: <20KD
C-H: 20-150 KD （c-h 分子量逐渐增大）
A-B图分离效果还可以接受，但是C-H分离效果很差，不知道原因，请高手指点。
另外，我考虑可能是蛋白质分离比较大 300 A的孔径可能不合适，但是我改用1000A的柱子效果也差不多是这样。请有相关方面经验的高手指教。

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1楼 2010-08-09 09:48:58

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sqhnsd

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引用回帖:

Originally posted by 皖山潜凤 at 2010-08-13 14:14:57:

看着图确实很怪异，怎么都不到基线呢？
你为啥不用
A液： 100%水 0.1% TFA
B液： 100% 乙腈 0.1% TFA

这样的话，在乙腈达到100%的时候，一切疏水的冻洗都应该下来，如果还不回到基线，那就说 ...

电洗脱的时候，里面有200mM的glycine，在丙酮沉淀之前我还对样品进行冻干以提高蛋白浓度，增加 actone precipitation回收率。但是，当弄干之后，盐分盐浓度就很高了（200mM其实已经比较高了），高盐情况下去除SDS效果不好（文章推荐除盐）。还有，大部分蛋白在0-60%乙腈的条件下都会洗掉，90%跟100%差别不大。另外，actone precipitation可以去除大部分SDS，因此必须放到RP-HPLC之前。你说的很对，我也觉得丙酮沉淀之后的蛋白，怪怪的

[ Last edited by sqhnsd on 2010-8-13 at 15:14 ]