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sqhnsd

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助】RP-HPLC分离蛋白质样品遇到的奇怪现象已有5人参与

本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质
柱子：C8 孔径 300 A
A液： 98% 水 2% 乙腈 0.1% TFA
B液： 90% 乙腈 10%水 0.1% TFA
样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（楼下有图）
A-B: <20KD
C-H: 20-150 KD （c-h 分子量逐渐增大）
A-B图分离效果还可以接受，但是C-H分离效果很差，不知道原因，请高手指点。
另外，我考虑可能是蛋白质分离比较大 300 A的孔径可能不合适，但是我改用1000A的柱子效果也差不多是这样。请有相关方面经验的高手指教。

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1楼2010-08-09 09:48:58

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皖山潜凤

银虫 (小有名气)

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★
zxz.1982(金币+1):感谢交流 2010-08-13 15:04:29

引用回帖:

Originally posted by sqhnsd at 2010-08-09 09:48:58:
本人最近在做RP-HPLC分离蛋白质
柱子：C8 孔径 300 A
A液： 98% 水 2% 乙腈 0.1% TFA
B液： 90% 乙腈 10%水 0.1% TFA
样本均为蛋白质复杂样本，每个组分大概包括50-100个左右的蛋白，只是分力量不同（ ...

看着图确实很怪异，怎么都不到基线呢？
你为啥不用
A液： 100%水 0.1% TFA
B液： 100% 乙腈 0.1% TFA

这样的话，在乙腈达到100%的时候，一切疏水的冻洗都应该下来，如果还不回到基线，那就说明你的样品有问题，没有那个分子的有那么强的疏水性质。

看你的这个图，感觉分辨率很低。另外你为啥要在丙酮沉淀去除盐和SDS后上HPLC，丙酮除掉盐的时候难道盐不会也析出来？按照经验，当样品中盐离子很高的时候，在用有机溶剂沉淀蛋白的时候，盐离子也是可以被沉淀下来的。反相柱子可以脱盐，但是多了对机器不好。另外丙酮沉淀后，很多蛋白性质会很怪的，我想一般这一步不应该放在这么靠后。

电洗脱这个步骤也太靠前了，感觉，

感觉应该是你的样品含有某种东西，但是说不好是什么？