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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi

[交流] 【求助/交流】绿色荧光蛋白时有时无怎么回事? 已有4人参与

现在我用利用绿色荧光蛋白作为筛选标记,在一株非常规酵母中表达(细胞壁比较厚),但是用激发光激发看到的荧光很不稳定,是蓝色的,非常微弱,但是跟野生的菌有区别(野生菌有点微微的绿色,模模糊糊的)。不是荧光蛋白都应该是很亮的么,为什么我挑起来这么费劲,每次都要在显微镜底下看半天,才挑到一个。
按道理我挑取一个菌落进行观察,单菌落中的菌都是一样的啊?可我看到的是一个单菌落中的菌有的有荧光,有的却没有,而且荧光菌大多数在盖玻片的周围观察到。十分怀疑是否是因为边缘折射的光线导致荧光的产生的。而且更加让人郁闷的是,原先大多数有荧光的菌储存一段时间以后再划线,荧光都消失了。。。。。。。。。。。
这个实验做了快一年了,每次看显微镜看完头都特别疼,晕乎乎,却总是不能肯定到底这个荧光是能表达还是不能,各位高手,请您走过路过一定帮帮忙,哪怕是提点建议或者我有可能疏忽的地方也好。
再次先谢过!!!
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但愿快乐不停歇,悲伤不再来~
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi

引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-28 22:11:42:
首先,你的GFP表达量如何?
而且你用的是GFP还是EGFP,单GFP的亮度并不高。
你先可以用一下fluorospectremeter,对cell lysate扫描并看看是否可能有其他的excitation wavelength并且测一下其fluorescence的强度了

我的荧光蛋白在FBA启动子,应该算是一个强启动子下表达的,这个质粒在菌中拷贝数不确定,有可能是单拷贝。
用的是GFP,没有用EGFP。试试EGFP可能可以。好建议,谢谢!
fluorospectremeter是什么啊?如果其余的细胞溶解物有荧光的话,我做个阴性对照不也可以排除么?测定细胞溶解物中的荧光有什么不同么?
但愿快乐不停歇,悲伤不再来~
4楼2010-07-29 17:07:30
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看天

木虫 (知名作家)


pushizi(金币+1):谢谢参与
希望有专业相关人员回答 顶
戒嗔怒以养肝气,省言语以养神气,多读书以养质气,顺时令以养元气,不拘节以养大气,观天变以养灵气,莫强求规于运气。
2楼2010-07-28 09:55:59
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★
pushizi(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):欢迎多来交流~~ 2010-07-29 09:45:09
pushizi(金币+5): 2010-07-29 17:07:39
首先,你的GFP表达量如何?
而且你用的是GFP还是EGFP,单GFP的亮度并不高。
你先可以用一下fluorospectremeter,对cell lysate扫描并看看是否可能有其他的excitation wavelength并且测一下其fluorescence的强度了
3楼2010-07-28 22:11:42
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-30 08:14:27
引用回帖:
Originally posted by pushizi at 2010-07-29 17:07:30:

我的荧光蛋白在FBA启动子,应该算是一个强启动子下表达的,这个质粒在菌中拷贝数不确定,有可能是单拷贝。
用的是GFP,没有用EGFP。试试EGFP可能可以。好建议,谢谢!
fluorospectremeter是什么啊?如果其余的 ...

如果是单拷贝,你的表达量必然比较少,荧光强度也不会很高
那个就是类似于uv-vis的东西,只不过测的是荧光了。他可以对excitation and emission wavelength做扫描,也可以测具体的荧光强度。
很多蛋白有荧光,但emission强度不高,并且wavelength比较小。你可以用对照去除的。
5楼2010-07-29 23:20:46
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