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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】绿色荧光蛋白时有时无怎么回事？
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi

[交流] 【求助/交流】绿色荧光蛋白时有时无怎么回事？ 已有4人参与

现在我用利用绿色荧光蛋白作为筛选标记，在一株非常规酵母中表达（细胞壁比较厚），但是用激发光激发看到的荧光很不稳定，是蓝色的，非常微弱，但是跟野生的菌有区别（野生菌有点微微的绿色，模模糊糊的）。不是荧光蛋白都应该是很亮的么，为什么我挑起来这么费劲，每次都要在显微镜底下看半天，才挑到一个。
按道理我挑取一个菌落进行观察，单菌落中的菌都是一样的啊？可我看到的是一个单菌落中的菌有的有荧光，有的却没有，而且荧光菌大多数在盖玻片的周围观察到。十分怀疑是否是因为边缘折射的光线导致荧光的产生的。而且更加让人郁闷的是，原先大多数有荧光的菌储存一段时间以后再划线，荧光都消失了。。。。。。。。。。。
这个实验做了快一年了，每次看显微镜看完头都特别疼，晕乎乎，却总是不能肯定到底这个荧光是能表达还是不能，各位高手，请您走过路过一定帮帮忙，哪怕是提点建议或者我有可能疏忽的地方也好。
再次先谢过！！！
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但愿快乐不停歇，悲伤不再来~
1楼 2010-07-27 21:24:42
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看天

木虫 (知名作家)
★
pushizi(金币+1):谢谢参与
希望有专业相关人员回答 顶
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
2楼2010-07-28 09:55:59
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★ ★
pushizi(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):欢迎多来交流~~ 2010-07-29 09:45:09
pushizi(金币+5): 2010-07-29 17:07:39
首先，你的GFP表达量如何？
而且你用的是GFP还是EGFP，单GFP的亮度并不高。
你先可以用一下fluorospectremeter，对cell lysate扫描并看看是否可能有其他的excitation wavelength并且测一下其fluorescence的强度了
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3楼2010-07-28 22:11:42
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-28 22:11:42:
首先，你的GFP表达量如何？
而且你用的是GFP还是EGFP，单GFP的亮度并不高。
你先可以用一下fluorospectremeter，对cell lysate扫描并看看是否可能有其他的excitation wavelength并且测一下其fluorescence的强度了

我的荧光蛋白在FBA启动子，应该算是一个强启动子下表达的，这个质粒在菌中拷贝数不确定，有可能是单拷贝。
用的是GFP，没有用EGFP。试试EGFP可能可以。好建议，谢谢！
fluorospectremeter是什么啊？如果其余的细胞溶解物有荧光的话，我做个阴性对照不也可以排除么？测定细胞溶解物中的荧光有什么不同么？
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4楼2010-07-29 17:07:30
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-07-30 08:14:27
引用回帖:
Originally posted by pushizi at 2010-07-29 17:07:30:

我的荧光蛋白在FBA启动子，应该算是一个强启动子下表达的，这个质粒在菌中拷贝数不确定，有可能是单拷贝。
用的是GFP，没有用EGFP。试试EGFP可能可以。好建议，谢谢！
fluorospectremeter是什么啊？如果其余的 ...

如果是单拷贝，你的表达量必然比较少，荧光强度也不会很高
那个就是类似于uv-vis的东西，只不过测的是荧光了。他可以对excitation and emission wavelength做扫描，也可以测具体的荧光强度。
很多蛋白有荧光，但emission强度不高，并且wavelength比较小。你可以用对照去除的。
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5楼2010-07-29 23:20:46
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leileihmr

新虫 (初入文坛)
★
pushizi(金币+1):谢谢参与
荧光过一段时间消失是正常现象吧
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6楼2010-07-30 09:39:54
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
Originally posted by leileihmr at 2010-07-30 09:39:54:
荧光过一段时间消失是正常现象吧

不正常！
我们实验室用大肠杆菌表达同一个基因，产生的荧光肉眼可见，提取的荧光蛋白-70℃保存一年以上都好好的，可亮了。
而且即使荧光蛋白放在室温保存两三个月了，还是好好地。
也就是说这个荧光蛋白的稳定性是毋庸置疑的。只是在我的这个菌中没有，这是很奇怪的。
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7楼2010-07-30 10:30:50
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pushizi

木虫 (小有名气)

pushizi
引用回帖:
Originally posted by lwiaanngg at 2010-07-29 23:20:46:


如果是单拷贝，你的表达量必然比较少，荧光强度也不会很高
那个就是类似于uv-vis的东西，只不过测的是荧光了。他可以对excitation and emission wavelength做扫描，也可以测具体的荧光强度。
很多蛋白有荧光 ...

我的荧光是在显微镜下观察到的，肉眼观察不到。。。。。。。。
这样的话用fluorospectremeter也好使么？
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8楼2010-07-30 10:32:37
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by pushizi at 2010-07-30 10:32:37:

我的荧光是在显微镜下观察到的，肉眼观察不到。。。。。。。。
这样的话用fluorospectremeter也好使么？

他的resolution应该比你的眼睛高，呵呵
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9楼2010-07-30 11:02:33
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