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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体构建的求助
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wuchao

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】载体构建的求助 已有4人参与

我想构建一个载体，通过XbaI和ClaI连接一个3K的片段和一个2K的载体，可是连了很久都没有成功，最近转化结果有较多的白斑（通过蓝白斑筛选），菌液PCR有目的条带，可是提出的质粒却只有2K大小，很奇怪，难道都是都是假阳性吗？
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1楼 2010-07-25 14:09:38
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
做个对照，多筛选几次，可以同时进行PCR和提质粒酶切验证！慢慢来~
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2010-07-25 17:55:07
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):积极的虫子 2010-07-25 20:16:42
提完的质粒有没有酶切线性化再看分子量？
另外，菌液PCR的假阳性确实蛮高的，你可以做一个空质粒菌液的PCR看看

这么长的片段，通常要在4℃连接过夜，同时用好一点点T4或者快速连接kit，否则比较困难
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2楼2010-07-25 15:12:35
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ymzfeng

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
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lstt09nk(金币+2):感谢分享 2010-07-25 20:17:17
菌落PCR假阳性是挺高的
菌落PCR是以菌种基因组和你的质粒为模板的
可以做个对照
我以前也遇到多这种情况
菌落PCR很好，质粒也提出来了
可质粒PCR和酶切都没结果
你连接的片段较大，连接效率也得考虑
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3楼2010-07-25 15:53:12
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glidingwater

银虫 (小有名气)
★
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目的片段长于载体的长度，影响着连接及表达。
建议更换为长度较于目的片段更长的载体。
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如果社会的黑暗侵蚀了学府，我该往何处？
5楼2010-07-25 20:10:56
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