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金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】构建的载体找不到目的序列已有3人参与

各位高人有没有遇到这种情况的：
构建的载体PCR可以得到目的序列，然则做单酶切后于原质粒大小无异，双酶切后也看不到目的条带的存在。
载体有4500bp，目的条带500bp。
个人觉得，质粒提取后，其目的条带与载体的浓度应当相同，因此双酶切后既然质粒的条带非常清晰，为何目的序列的条带压根不见呢？

加油哦↖(^ω^)↗，O(∩_∩)O哈哈~

1楼2010-08-19 15:53:28

木虫 (著名写手)

我們是糖甜到憂傷

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

pcr所用引物是什么引物？载体通用引物还是扩增片段的特异性引物？
基因来源是？
这种情况可能是你的基因在宿主中本来就存在。

Thank-you，so-blue.

2楼2010-08-23 16:12:31

木虫 (小有名气)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

个人认为酶切时没有切开，所以才会出现你说的情况。可以考虑一下测序，看看到底目的基因是否已连入载体。若还出现其他问题可以继续交流。

3楼2010-08-23 16:33:32

木虫 (正式写手)

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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

正常的，多切点看看，
酶切后浓度应该是4500:500，即9:1哦，所以载体条带可见，外源片段条带不可见

4楼2010-08-23 17:42:13

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