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wuchao

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】载体构建的求助 已有4人参与

我想构建一个载体,通过XbaI和ClaI连接一个3K的片段和一个2K的载体,可是连了很久都没有成功,最近转化结果有较多的白斑(通过蓝白斑筛选),菌液PCR有目的条带,可是提出的质粒却只有2K大小,很奇怪,难道都是都是假阳性吗?
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

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lstt09nk(金币+2):积极的虫子 2010-07-25 20:16:42
提完的质粒有没有酶切线性化再看分子量?
另外,菌液PCR的假阳性确实蛮高的,你可以做一个空质粒菌液的PCR看看

这么长的片段,通常要在4℃连接过夜,同时用好一点点T4或者快速连接kit,否则比较困难
2楼2010-07-25 15:12:35
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ymzfeng

金虫 (小有名气)

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lstt09nk(金币+2):感谢分享 2010-07-25 20:17:17
菌落PCR假阳性是挺高的
菌落PCR是以菌种基因组和你的质粒为模板的
可以做个对照
我以前也遇到多这种情况
菌落PCR很好,质粒也提出来了
可质粒PCR和酶切都没结果
你连接的片段较大,连接效率也得考虑
3楼2010-07-25 15:53:12
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

做个对照,多筛选几次,可以同时进行PCR和提质粒酶切验证!慢慢来~
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
4楼2010-07-25 17:55:07
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glidingwater

银虫 (小有名气)


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目的片段长于载体的长度,影响着连接及表达。
建议更换为长度较于目的片段更长的载体。
如果社会的黑暗侵蚀了学府,我该往何处?
5楼2010-07-25 20:10:56
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