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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率？
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率？ 已有7人参与

最近在做一个TA克隆，经蓝白斑筛选后，得到白斑，经PCR鉴定，结果全为阴性！郁闷了，运气也实在太差了点，十几个菌落中都挑不出一个正向的！（PCR体系应该不会有问题，前几天刚做了另外一个重组的鉴定！）怎么样才能提高TA克隆的正向连接效率呢？做过的大虾们请指点一下！
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1楼 2010-07-19 09:02:03
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-19 09:16:57
何不直接双酶切克隆？位点很特殊？
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2楼2010-07-19 09:07:31
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:07:31:
何不直接双酶切克隆？位点很特殊？

我们现在用的是T载体平台，想省掉PCR产物酶切这一步！
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3楼2010-07-19 09:18:47
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+3):good！ 2010-07-19 20:10:15
引用回帖:
Originally posted by aofeng860308 at 2010-07-19 09:18:47:

我们现在用的是T载体平台，想省掉PCR产物酶切这一步！

也就是说纯克隆，不表达？
传统TA克隆是没办法定向的啵
我查到有个定向法，不过也是要经过酶切去掉反向重组质粒
http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-5/2010521173606846.htm

或者你考虑Invitrogen的TOPO定向克隆系统吧~~不够我没用过，但据说效果一流
http://zh.invitrogen.com/site/cn ... l-TOPO-cloning.html
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4楼2010-07-19 09:39:35
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
lz运气太背了
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
5楼2010-07-19 10:12:18
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liouwzh

木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-07-19 22:57:02
只能进行双酶切了，TA克隆基本上随机的。但是也有可能跟序列有关，某些序列连接可能有偏好性。
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6楼2010-07-19 10:34:45
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)
序列相关，而且运气很重要......
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7楼2010-07-19 11:07:46
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:39:35:


也就是说纯克隆，不表达？
传统TA克隆是没办法定向的啵
我查到有个定向法，不过也是要经过酶切去掉反向重组质粒
http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-5/2010521173606846.htm

或者你考虑In ...

谢谢了，看来是没有简便易行的方法了！
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8楼2010-07-19 18:37:59
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-19 10:12:18:
lz运气太背了

是啊，真是个杯具|……
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9楼2010-07-19 18:38:53
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
我问个问题啊，正反向怎么用PCR检测出来的？是用一个正向载体引物，和一个反向PCR引物检测的吗？
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10楼2010-07-19 22:23:21
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