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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率? 已有7人参与

最近在做一个TA克隆,经蓝白斑筛选后,得到白斑,经PCR鉴定,结果全为阴性!郁闷了,运气也实在太差了点,十几个菌落中都挑不出一个正向的!(PCR体系应该不会有问题,前几天刚做了另外一个重组的鉴定!)怎么样才能提高TA克隆的正向连接效率呢?做过的大虾们请指点一下!
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+3):good! 2010-07-19 20:10:15
引用回帖:
Originally posted by aofeng860308 at 2010-07-19 09:18:47:

我们现在用的是T载体平台,想省掉PCR产物酶切这一步!

也就是说纯克隆,不表达?
传统TA克隆是没办法定向的啵
我查到有个定向法,不过也是要经过酶切去掉反向重组质粒
http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-5/2010521173606846.htm

或者你考虑Invitrogen的TOPO定向克隆系统吧~~不够我没用过,但据说效果一流
http://zh.invitrogen.com/site/cn ... l-TOPO-cloning.html
4楼2010-07-19 09:39:35
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-07-19 09:16:57
何不直接双酶切克隆?位点很特殊?
2楼2010-07-19 09:07:31
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:07:31:
何不直接双酶切克隆?位点很特殊?

我们现在用的是T载体平台,想省掉PCR产物酶切这一步!
3楼2010-07-19 09:18:47
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liouwzh

木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
scelab(金币+1):欢迎多来交流!:tiger06: 2010-07-19 22:57:02
只能进行双酶切了,TA克隆基本上随机的。但是也有可能跟序列有关,某些序列连接可能有偏好性。
6楼2010-07-19 10:34:45
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