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aofeng860308

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】怎么样提高TA克隆的正向连接概率? 已有7人参与

最近在做一个TA克隆,经蓝白斑筛选后,得到白斑,经PCR鉴定,结果全为阴性!郁闷了,运气也实在太差了点,十几个菌落中都挑不出一个正向的!(PCR体系应该不会有问题,前几天刚做了另外一个重组的鉴定!)怎么样才能提高TA克隆的正向连接效率呢?做过的大虾们请指点一下!
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:07:31:
何不直接双酶切克隆?位点很特殊?

我们现在用的是T载体平台,想省掉PCR产物酶切这一步!
3楼2010-07-19 09:18:47
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-07-19 09:39:35:


也就是说纯克隆,不表达?
传统TA克隆是没办法定向的啵
我查到有个定向法,不过也是要经过酶切去掉反向重组质粒
http://www.ebiotrade.com/newsf/2010-5/2010521173606846.htm

或者你考虑In ...

谢谢了,看来是没有简便易行的方法了!
8楼2010-07-19 18:37:59
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-19 10:12:18:
lz运气太背了

是啊,真是个杯具|……
9楼2010-07-19 18:38:53
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aofeng860308

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-07-19 22:23:21:
我问个问题啊,正反向怎么用PCR检测出来的?是用一个正向载体引物,和一个反向PCR引物检测的吗?

是的 ,就是这样!
11楼2010-08-15 09:13:04
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