24小时热门版块排行榜    

查看: 3037  |  回复: 25

bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 【求助/交流】关于平末端连接 已有12人参与

最近做定向克隆,用的两个酶,一个是XbaI ,另一个是SmaI,第二个是平端的。做连接的时候摩尔比例都没有问题,50%的PEG4000也加过了,但是总是连接失败。
在这之前我有做过凸出端补平,再进行平末端连接的实验,感觉挺容易连接的,不知道为什么现在就总是失败。
请大家帮忙一下,分享一下做平端连接的经验,或者帮我分析一下什么地方可能出现问题,谢谢啦~~
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

干嘛引入平端?
仕不可不弘毅,任重而道远
2楼2010-06-22 12:18:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-06-22 12:18:24:
干嘛引入平端?

没有其他合适的酶切位点了~
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
3楼2010-06-23 18:39:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:00:13
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸
4楼2010-06-23 18:41:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:01:16
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-06-24 17:16:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

去磷酸化吧
6楼2010-06-24 17:30:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-24 17:16:10:
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊

没有转化子啊,都做了好几次了,一个菌也不长……很郁闷
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
7楼2010-06-25 08:01:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-06-23 18:41:11:
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸

我就是用酶切开后,纯化回收的产物,和以前一样做的。
如何确定是否有5‘端有磷酸呢?
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
8楼2010-06-25 08:02:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-24 17:16:10:
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊

请教一下,请问你在做平端连接(仍是定向克隆,一个有凸出,一个是平端)的时候,是什么样的连接组分呢?
我用的是fermentas的酶
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
9楼2010-06-25 08:28:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-06-25 08:02:15:

我就是用酶切开后,纯化回收的产物,和以前一样做的。
如何确定是否有5‘端有磷酸呢?

那就没事,酶切产物有磷酸的
10楼2010-06-25 08:53:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 bettyshan 的主题更新
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +4 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:54 by yCO1Ll7aHtsw
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 4/200 2026-09-29 16:37 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 16:03 by etmYJ6d2rquH
[考博] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +6 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 6/300 2026-09-29 14:41 by etmYJ6d2rquH
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:30 by etmYJ6d2rquH
[考研] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 3/150 2026-09-29 14:24 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +6 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 7/350 2026-09-29 14:07 by etmYJ6d2rquH
[博后之家] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-29 13:56 by etmYJ6d2rquH
[公派出国] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-29 13:50 by etmYJ6d2rquH
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意! +8 zju2000 2026-09-26 9/450 2026-09-29 13:47 by ahsoarli
[考研] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 tqUTOxClQUMF 2026-09-28 3/150 2026-09-29 09:59 by JzYBbHIXWSrW
[教师之家] 售一区SCI文章T0P,我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 4/200 2026-09-29 09:49 by JzYBbHIXWSrW
[考研] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:42 by ZvyPK8n6Nfki
[找工作] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 ZYXdhzDAy9ZX 2026-09-28 3/150 2026-09-29 06:28 by ZvyPK8n6Nfki
[考研] 售SCI一区文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 GDBe8tDZqE8z 2026-09-28 3/150 2026-09-28 23:12 by b8fCuTHqckEt
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章,我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 CfXuS1rDhLYN 2026-09-28 4/200 2026-09-28 22:55 by ez6fGg9abYaj
[有机交流] 同一个分子,一条来自文献,一条来自AI——不告诉你答案,你会选哪条? +3 tianxiaoxian 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:44 by tianxiaoxian
[找工作] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 5/250 2026-09-28 22:32 by ez6fGg9abYaj
[博后之家] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 3/150 2026-09-28 22:21 by ez6fGg9abYaj
[考博] 售SCI文章,我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +3 IDs3scOF0tjC 2026-09-28 6/300 2026-09-28 22:15 by ez6fGg9abYaj
信息提示
请填处理意见