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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于平末端连接
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-06-24 17:30:24:
去磷酸化吧

估计那样就永远也做不出来了。。呵呵
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
11楼2010-06-25 09:36:28
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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★
bettyshan(金币+1): 2010-06-25 15:07:15
lstt09nk(金币+1):鼓励交流~ 2010-09-08 09:22:55
引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-06-25 08:01:06:

没有转化子啊，都做了好几次了，一个菌也不长……很郁闷

连个载体自连的都没有。。。会不会是：感受态，连接酶，培养基抗生素或者是载体完全切开但是片段没有切开（片段保护碱基没错吧）原因啊，，，下次对照 转点质粒看看吧

你检测回收质粒效果了吗，

连接时载体少加，片段量要大：我一般要远超过载体片段：目的片段远小于3  
应该好做的，你再具体分析一下你的吧。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
12楼2010-06-25 09:44:36
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-25 09:44:36:


连个载体自连的都没有。。。会不会是：感受态，连接酶，培养基抗生素或者是载体完全切开但是片段没有切开（片段保护碱基没错吧）原因啊，，，下次对照 转点质粒看看吧

你检测回收质粒效果了吗，

连接时 ...

有做阳性对照，转化没有问题。因为是双酶切，应该不会有自连的吧……片段是从T载体上切下来的，大小正确，说明能切开的，载体和片段同时进行的双酶切，所以应该酶切也是没有问题的。我以前听人家说平端难连，但是之前一直都能连上，就是最近这两个怎么也连不上了，好是奇怪啊……
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我们都是芸芸众生的小人物，相遇相知，都是幸福！
13楼2010-06-25 15:09:52
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沐风望野

铜虫 (初入文坛)
我也是SmaI酶切以后做平端连接，之前连接的一下就出来了，但是这次连了好几次，一个转化子也没有，排除了其他因素的影响了
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14楼2010-07-22 15:37:22
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zijing5322

铁虫 (小有名气)
我也曾用过这两个酶 酶切连接 连接时间久一点，连接酶量可以适当加大。。。
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15楼2010-07-23 14:08:18
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-24 17:16:10:
平末端还是挺好连接的，你出现的是什么情况：没有转化子 还是 全是载体自连啊

有转化子，但是基本上都是自连的~我还用CIP处理过了~
我具体的做法是，平端切后，载体和片段都进行去磷酸化处理，再连接。连接的时候加PEG~
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16楼2010-09-08 09:12:26
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江诚1990

金虫 (小有名气)
有平连的Protocol吗？我也要做平连
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天道酬勤
17楼2011-03-30 14:40:05
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shaquila

金虫 (正式写手)
bettyshan(金币+1): 问题已经解决，谢谢~~· 2011-03-31 08:09:26
楼主，两个只能一个去磷酸化，如果一个平一个粘发生自连，把载体去磷酸化，片段量加大，同时感受态活性很重要，一般粘端连会出来，平端未必出来的
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18楼2011-03-30 15:08:54
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咸鱼

金虫 (小有名气)
bettyshan(金币+1): 2011-03-31 08:09:02
你换用NEB酶试试，我这样子做出来过。
不过克隆这东西很奇怪，经常不知为什么就连不上。我前一阵子做个克隆，做了四五遍没做成，后来换我一个师妹给我做，什么都没换，就换了个人，结果就做出来了~太奇怪了。
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19楼2011-03-30 20:53:55
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kwkw

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 咸鱼 at 2011-03-30 20:53:55:
你换用NEB酶试试，我这样子做出来过。
不过克隆这东西很奇怪，经常不知为什么就连不上。我前一阵子做个克隆，做了四五遍没做成，后来换我一个师妹给我做，什么都没换，就换了个人，结果就做出来了~太奇怪了。

跟人品有关！
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再苦：也别忘记坚持！再烦：也别忘记微笑！再急：也要注意语气！再累：也要爱自己！低调做人，你会一次比一次稳健。高调做事，你会一次比一次优秀！
20楼2011-04-01 11:05:09
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