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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 【求助/交流】关于平末端连接 已有12人参与

最近做定向克隆,用的两个酶,一个是XbaI ,另一个是SmaI,第二个是平端的。做连接的时候摩尔比例都没有问题,50%的PEG4000也加过了,但是总是连接失败。
在这之前我有做过凸出端补平,再进行平末端连接的实验,感觉挺容易连接的,不知道为什么现在就总是失败。
请大家帮忙一下,分享一下做平端连接的经验,或者帮我分析一下什么地方可能出现问题,谢谢啦~~
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-25 09:44:36:


连个载体自连的都没有。。。会不会是:感受态,连接酶,培养基抗生素或者是载体完全切开但是片段没有切开(片段保护碱基没错吧)原因啊,,,下次对照 转点质粒看看吧

你检测回收质粒效果了吗,

连接时 ...

有做阳性对照,转化没有问题。因为是双酶切,应该不会有自连的吧……片段是从T载体上切下来的,大小正确,说明能切开的,载体和片段同时进行的双酶切,所以应该酶切也是没有问题的。我以前听人家说平端难连,但是之前一直都能连上,就是最近这两个怎么也连不上了,好是奇怪啊……
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13楼2010-06-25 15:09:52
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-06-22 12:18:24:
干嘛引入平端?

没有其他合适的酶切位点了~
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3楼2010-06-23 18:39:10
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ben1147

木虫 (正式写手)

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:00:13
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸
4楼2010-06-23 18:41:11
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:01:16
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-06-24 17:16:10
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