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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 【求助/交流】关于平末端连接已有12人参与

最近做定向克隆,用的两个酶,一个是XbaI ,另一个是SmaI,第二个是平端的。做连接的时候摩尔比例都没有问题,50%的PEG4000也加过了,但是总是连接失败。
在这之前我有做过凸出端补平,再进行平末端连接的实验,感觉挺容易连接的,不知道为什么现在就总是失败。
请大家帮忙一下,分享一下做平端连接的经验,或者帮我分析一下什么地方可能出现问题,谢谢啦~~
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

干嘛引入平端?
仕不可不弘毅,任重而道远
2楼2010-06-22 12:18:24
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-06-22 12:18:24:
干嘛引入平端?

没有其他合适的酶切位点了~
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3楼2010-06-23 18:39:10
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ben1147

木虫 (正式写手)

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:00:13
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸
4楼2010-06-23 18:41:11
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:01:16
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-06-24 17:16:10
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主

去磷酸化吧
6楼2010-06-24 17:30:24
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-24 17:16:10:
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊

没有转化子啊,都做了好几次了,一个菌也不长……很郁闷
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
7楼2010-06-25 08:01:06
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by ben1147 at 2010-06-23 18:41:11:
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸

我就是用酶切开后,纯化回收的产物,和以前一样做的。
如何确定是否有5‘端有磷酸呢?
我们都是芸芸众生的小人物,相遇相知,都是幸福!
8楼2010-06-25 08:02:15
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-06-24 17:16:10:
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊

请教一下,请问你在做平端连接(仍是定向克隆,一个有凸出,一个是平端)的时候,是什么样的连接组分呢?
我用的是fermentas的酶
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9楼2010-06-25 08:28:15
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ben1147

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by bettyshan at 2010-06-25 08:02:15:

我就是用酶切开后,纯化回收的产物,和以前一样做的。
如何确定是否有5‘端有磷酸呢?

那就没事,酶切产物有磷酸的
10楼2010-06-25 08:53:23
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