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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

[交流] 【求助/交流】关于平末端连接 已有12人参与

最近做定向克隆,用的两个酶,一个是XbaI ,另一个是SmaI,第二个是平端的。做连接的时候摩尔比例都没有问题,50%的PEG4000也加过了,但是总是连接失败。
在这之前我有做过凸出端补平,再进行平末端连接的实验,感觉挺容易连接的,不知道为什么现在就总是失败。
请大家帮忙一下,分享一下做平端连接的经验,或者帮我分析一下什么地方可能出现问题,谢谢啦~~
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kwkw

木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by 咸鱼 at 2011-03-30 20:53:55:
你换用NEB酶试试,我这样子做出来过。
不过克隆这东西很奇怪,经常不知为什么就连不上。我前一阵子做个克隆,做了四五遍没做成,后来换我一个师妹给我做,什么都没换,就换了个人,结果就做出来了~太奇怪了。

跟人品有关!
再苦:也别忘记坚持!再烦:也别忘记微笑!再急:也要注意语气!再累:也要爱自己!低调做人,你会一次比一次稳健。高调做事,你会一次比一次优秀!
20楼2011-04-01 11:05:09
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bettyshan

木虫 (正式写手)

梦幻biobrick

引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-06-22 12:18:24:
干嘛引入平端?

没有其他合适的酶切位点了~
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3楼2010-06-23 18:39:10
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ben1147

木虫 (正式写手)

bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:00:13
那就不加PEG了。。。。。。。。。。

另外确定载体和片段至少二者有一个5‘端要有磷酸
4楼2010-06-23 18:41:11
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

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bettyshan(金币+1): 2010-06-25 08:01:16
平末端还是挺好连接的,你出现的是什么情况:没有转化子 还是 全是载体自连啊
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
5楼2010-06-24 17:16:10
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