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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒提的量不多
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tdong06

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】质粒提的量不多 已有14人参与

我最近做了个枯草芽孢杆菌的gfp质粒的电转化，质粒电转化进去之后再从枯草芽孢杆菌里抽提质粒，抽提的量就显得很少，带很淡。与大肠中的质粒相比就差多了，不知道是什么原因？
大家帮忙分析下。。。
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1楼 2010-05-28 17:40:23
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by 桂花啊 at 2010-05-28 19:53:05:
质粒电转化的效率高吗？做检测了吗？

这个与转化效率的关系应该不是很大吧？我是挑选有绿色荧光的转化子加抗生素摇的，摇了24h后那个OD达到2.0的样子，用质粒试剂盒提取质粒，平常的大肠杆菌之类都是很容易抽提得到很亮的条带，但是这个枯草芽孢杆菌是不行的。所以这个不知道是怎么回事，是不是枯草芽孢的细胞壁比较厚呢？
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4楼2010-05-28 20:47:43
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by snzydong at 2010-05-28 18:44:26:
这很正常吧，枯草芽孢杆菌不像大肠杆菌那么容易培养吧，所以可能提出来的质粒的量就不高。

不是的吧？这个枯草长的还是很快的。菌量不会差的啊！
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5楼2010-05-28 20:49:43
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by gastrodia at 2010-05-28 23:17:17:
你以为其他的菌里面质粒的拷贝数都像大肠杆菌一样

这个就不是很懂了，请赐教。。。
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7楼2010-05-29 08:31:21
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by yangjunzju at 2010-05-29 12:03:52:
质粒淡的话可以用两种方法改善：1.菌液量用多一些；2.最后的EB少用一些；这样的话效果会好一些

但是为什么和从大肠杆菌中提到的相同质粒相比，从枯草芽孢杆菌中提到的量就要少呢？带要淡呢？
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12楼2010-05-29 21:36:27
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by gene001 at 2010-05-30 09:17:12:
主要原因是枯草杆菌质粒拷贝数比较低，真要做枯草杆菌表达系统，我建议参考大肠杆菌提高质粒拷贝的方法来改造一下你的质粒载体，甚至有条件可以对菌株进行相应的遗传改良，不过这工作会比较难吧！但是真的做好了你 ...

至少可以发个AEM了，呵呵。。。
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19楼2010-05-30 14:16:01
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by wangqk198738 at 2010-05-30 08:13:48:
那就多离心几次菌啊，这样不就多点了，此外，放在超净台上用微风吹，多吹一会，不然水不会轻易跑掉的，这样你要的浓度就大了，我经常这么干。很好使。

增加菌体浓度？但是加了浓液2后，那个不透明啊！
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20楼2010-05-30 14:17:21
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by scien55 at 2010-05-30 00:34:35:
是多拷贝质粒吗？能在枯草杆菌里面复制吗

恩，是的，是一个带有gfp的穿梭载体。能够很好的表达。
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21楼2010-05-30 14:18:06
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by wangqk198738 at 2010-05-30 14:28:49:

不透明沉淀——你可以使劲吹打啊，用枪头搅拌一下，不久碎开了。对伐！

会有DNA污染的，在溶液2加入的时候要小心的转动的。
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24楼2010-05-31 11:02:14
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tdong06

木虫 (正式写手)
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Originally posted by scien55 at 2010-05-31 14:10:18:
把溶液1换成水，，看看，，，破菌后稍微多放一段时间，   
有时候试剂盒抽的也有问题，，， 换个抽质粒的柱子看看  ，，确保洗涤的时候的酒精浓度在75%以上。。

OK，谢谢。。。
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26楼2010-05-31 20:14:26
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