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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pcr,酶切，连接，哪步可以省？
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xzx135

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pcr,酶切，连接，哪步可以省？ 已有13人参与

pcr,酶切，哪步可以省？
比如PCR后产物要与T载体连接，筛选阳性克隆后，然后再提质粒，酶切连接到目的载体上，这步有必要吗？PCR产物胶回收后，与目的质粒载体同时双酶切，然后就直接连接不行吗？
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1楼 2010-05-19 16:28:38
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zestyhuan

新虫 (初入文坛)
可以省，本人就这么做过，哈哈
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2楼2010-05-19 16:37:27
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dhmdddd

木虫 (正式写手)
直接连片段的话，那样效率比较低吧……
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上班族，学习ing……
3楼2010-05-19 16:45:28
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miya173

银虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-19 18:45:44
PCR产物回收，与目的质粒载体同时酶切，然后把需要的片段胶回收做链接。
从来没连到T载体上过
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4楼2010-05-19 17:57:23
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hyw1989960

木虫 (正式写手)

快乐家族二十八
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1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-19 18:46:00
连接到T载体是为了测序，不测的话根本不用这一部，如果嫌模板浓度低，可以重扩几次
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快乐家族
5楼2010-05-19 18:01:19
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
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直接双酶切，连接，测序
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6楼2010-05-19 22:30:26
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boystrong

银虫 (正式写手)
哈哈，楼主个性我喜欢。我就是这么懒的人。一般PCR出来以后，出去里面的杂质，即纯化目的片段后连接载体，连接好后（如果不是单酶切，PCR产物与载体同时酶切）即可加入感受态细胞，提取质粒。获得大量质粒一次加入表达菌，利用抗生素筛选，基本一挑一个中，三天即可表达
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梦想追风
7楼2010-05-20 12:18:18
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changes

木虫 (正式写手)
★
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省？也可以省。但是不推荐啊。
万一PCR扩增出来有错配的碱基，即你的扩增带与你的目的带有个别碱基不同，造成序列不同。那么你后续的表达还有意义吗？可能是白忙活啊。毕竟我们不能保证扩增的完全一致。
因此，保险起见还是通过第三方载体过度一下，多了一步，可能耗费了两天时间（加上测序时间是4天左右），但是结果自己能放心啊。
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8楼2010-05-20 19:53:02
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王雨云

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意楼上的说法！
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9楼2010-05-20 22:14:18
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
从来不用T载体。直接连。
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生物资源交流QQ群：1044518333
10楼2010-05-20 22:46:10
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