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xzx135

铁杆木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pcr,酶切,连接,哪步可以省? 已有13人参与

pcr,酶切,哪步可以省?
比如PCR后产物要与T载体连接,筛选阳性克隆后,然后再提质粒,酶切连接到目的载体上,这步有必要吗?PCR产物胶回收后,与目的质粒载体同时双酶切,然后就直接连接不行吗?
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changes

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
省?也可以省。但是不推荐啊。
万一PCR扩增出来有错配的碱基,即你的扩增带与你的目的带有个别碱基不同,造成序列不同。那么你后续的表达还有意义吗?可能是白忙活啊。毕竟我们不能保证扩增的完全一致。
因此,保险起见还是通过第三方载体过度一下,多了一步,可能耗费了两天时间(加上测序时间是4天左右),但是结果自己能放心啊。
8楼2010-05-20 19:53:02
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zestyhuan

新虫 (初入文坛)

可以省,本人就这么做过,哈哈
2楼2010-05-19 16:37:27
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

直接连片段的话,那样效率比较低吧……
上班族,学习ing……
3楼2010-05-19 16:45:28
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miya173

银虫 (小有名气)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
1949stone(金币+1):谢谢交流 2010-05-19 18:45:44
PCR产物回收,与目的质粒载体同时酶切,然后把需要的片段胶回收做链接。
从来没连到T载体上过
4楼2010-05-19 17:57:23
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