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qinfujun

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[交流] 【原创】水稻原生质体转化瞬时表达已有5人参与

Rice protoplast preparation
Rice protoplast preparation
Our protoplast isolation protocol was based on the protocol for maize protoplasts provided online by J. Sheen’s laboratory http://genetics.mgh.harvard.edu/sheenweb with several changes.

1. 将37℃萌发的水稻种子播种在PCR板上与28℃暗中培养7-9天 Rice seeds were grown in plastic pots filled with soil either in the light or in the dark at 28℃. Between 7 and 14 days post germination, plants were~10-20cm tall.
2. 纯化转化用质粒20ul,每ul要达1ug。
3. 配制10-15ml酶液和40ml 0.6M Mannitol平衡液（甘露醇，现配）等，最好用灭过菌的三角瓶，检查其他溶液，若出现沉淀则需重配。
4. 取幼苗，把根切下后浸在0.6M Mannitol中，用0.6M Mannitol浸湿切口，用吉列刀片切，越小越好，一旦刀片不锋利就换，切到叶片处停止，换新的切，将切下的放入0.6M Mannitol中，平衡10min。用100目叠200目筛子过滤后（目的是过滤Mannitol，只留组织），将切碎的组织投入酶液中，抽真空5min（可不抽），在250ml的三角瓶中用牛皮纸或铝箔刨包裹，摇床上以80转/min在28℃摇4hr-5hr（黑暗）。[250 ml flask for 10-20ml enzyme solution]。此时配W5和Mmg，摇后液体会变略浑浊。
5. 经200目和100目筛子过滤（任何一种均可），用剪口枪头吸，装入10ml tube中。可取一点做镜检，40×和20×下能看到20-40个就可以，圆的有大有小。
6. 提篮离心85g， 3-5min（离完后可见明显的浑浊沉淀在管底），（剪口枪头吸取）弃上清，慢慢沿管壁加入4ml W5溶液，轻轻用剪口枪头吸打，再离心600rpm，3-5min（在50ml tube中离心）
7. 弃上清，加入预冷的Mmg溶液4ml（加管壁上），600rpm，3-5min，弃上清重加入2ml Mmg溶液，充分悬浮，冰浴30min。
8. 600rpm，3-5min离心沉淀原生质体，（剪口枪头吸取）弃上清，补Mmg至每质粒100ul左右。
9. 在2ml tube中，每100ul原生质体，依次加入20ul质粒，和120ul 40%PEG，充分混匀（不用枪混），室温20min。
10. 加入1ml W5溶液，混匀，轻洗，最后加10ml W5。
11. 转移到六孔培养板，用锡纸包，28℃暗培养20-24hrs，可见白色小块，为死的原生质体，如果多的话要过滤。
12. 600rpm，5min，提篮离心，用剪口枪头收集原生质体，即可观察。（离心后看见沉淀，用枪将上清吸出，只留一点液体，有白色絮状）。
**凡涉及原生质体的转移和PEG的添加时，均须用剪口的并经火焰轻烧过的枪头。

Enzyme solution  现用现配，可头天晚上配好后放入冰箱
(0.6M Mannitol, 100mM MES母液(pH5.7), 1.5%Cellulase RS, 0.75% Macerozyme, 0.1%BSA, 1mM CaCl2, 5mM β-mercaptoethanol and 50 ug/ml carbenicillin（可抑制细菌生长）)
55℃（让酶可溶，加酶后会变棕色），10min，然后自然冷却后，可用
W5 solution(ddh2o配，放时间太长易长菌) KOH调pH
154mM NaCl, 125 mM CaCl2, 5 mM KCl, 2 mM MES(pH5.7)
Mmg solution(ddh2o配)
0.6M Mannitol, 15 mM MgCl2, 4 mM MES(pH5.7)
40%PEG （分装，25℃保管）KOH调pH 偏碱性好，7.5-8.0之间
0.6M Mannitol, 100 mM CaCl2, 40% v/v PEG 335
W5 solution 100ml
154 mM NaCl             0.9g
125 mM CaCl2                1.84g
5 mM KCl                5ml 100mM(母液)
2 mM MES             2ml 100mM(母液)
配好后加20ul CN(250浓度)
Mmg solution 10ml
0.6M Mannitol          1.093g
15 mM MgCl2                1.5ml    100mM(母液)
4 mM MES             400ul    100mM(母液)

100 mM MES 100ml （灭菌后4℃保存）
1.95g 加h2o至100ml， pH5.7（KOH调）
Rice protoplast preparation （所有试剂进口）
100 mM MES 100ml （灭菌后4℃保存）
1.95g 加h2o至100ml， pH5.7（KOH调）
2.1326g（•2h2o）

100 mM CaCl2 MW:111(无水)
   1.11g 加h2o至100ml
   1.4702g（•2h2o）

100 mM KCl    MW:74.55(无水)
   0.746g加h2o至100ml

100 mM MgCl2    MW: 95
   95 g加h2o至100ml

0.6M Mannitol 40ml
   4.37 g加h2o至40ml
Mannitol MV:182.17
Cellulose RS
Macerozyme
BSA
Carbenicillin
MgCl2
NaCl
CaCl2
PEG3350
50ml 灭菌三角瓶
蓝吉列刀片
筛子
灭菌平皿
灭菌10ml tubes
灭菌2 ml tubes
六孔培养板
灭菌1ml 枪头剪口，烧过
200ul 12个以上
W5 solution 100ml
154 mM NaCl             0.9g
125 mM CaCl2          1.84g    2.44g（2H2o）
5 mM KCl                5ml 100mM(母液)
2 mM MES             2ml 100mM(母液)
CN                   20ul
Add h2o to 100ml
Mmg solution 10ml
0.6M Mannitol          1.093g
15 mM MgCl2                1.5ml    100mM(母液)
4 mM MES             400ul    100mM(母液)
Add h2o to 10ml
40%PEG  10ml
0.6M Mannitol          1.093g
100 mM CaCl2•2h2o    0.147g
40%PEG3350             4g
Add h2o to 10ml
KOH调pH 7.5-8.0分装入1.5ml tubes  -20℃保存
Enzyme solution  10-15ml
0.6M Mannitol          1.093g
10 mM MES （pH5.7） 1ml  100mM(母液)
1.5% Cellulose RS       0.15g
0.75% Macerozyme       0.075g
0.1%BSA                0.01g
1 mM CaCl2                   0.1ml  100mM(母液)
0.25g/ml Carbenicillin    2ul
Add h2o to 10ml
55℃  10min 自然冷却变棕色
现配或提前配放4℃过夜

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