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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】菌液PCR和酶切的结果不符
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liuwei78

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】菌液PCR和酶切的结果不符 已有11人参与

我实验用到的载体片段长3000多，目的基因片段长2000多。导入大肠杆菌后菌液PCR得到的条带和预期一致，但是单酶切以后得到的条带却只有2000多bp。已经检查过了片段上应该只有一个酶切位点，那么为啥会出现这种情况呢
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1楼 2010-04-22 11:13:24
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by liuwei78 at 2010-04-22 11:13:24:
我实验用到的载体片段长3000多，目的基因片段长2000多。导入大肠杆菌后菌液PCR得到的条带和预期一致，但是单酶切以后得到的条带却只有2000多bp。已经检查过了片段上应该只有一个酶切位点，那么为啥会出现这种情况呢

我用的是单酶切，而且目的片段上没有这个酶切位点，载体上有一个
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8楼2010-04-23 09:30:32
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2010-04-22 13:06:30:
是不是电泳没跑开？3000和2000要分开可是低电压得跑稀的长胶

我做的是单酶切，载体上有一个这样的酶切位点，目的基因上分析过是没有的。连接的方式是TA连接，引物上没有再引入酶切位点了。

[ Last edited by liuwei78 on 2010-4-23 at 09:35 ]
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9楼2010-04-23 09:31:52
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
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Originally posted by xiangquanju at 2010-04-22 13:28:32:
第一：PCR可能是假阳性结果
第二：检验酶切体系是否有问题，应该做个对照，最好是单双酶切一起做~~

我也怀疑是假阳性，不过为什么连载体的大小都没有P出来呢
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10楼2010-04-23 09:34:19
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiangquanju at 2010-04-22 13:29:25:
还有你的载体上是否也有这个酶切位点呢~~

载体上有这个酶切位点，不过引物设计时没有引入酶切位点，是直接TA连接的
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11楼2010-04-23 09:36:26
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiangquanju at 2010-04-23 11:15:38:

T载体上是将多克隆位点去掉了的，不知道你是用的载体上的什么酶切位点？

用的是pMD19-T,上面有挺多酶切位点的
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16楼2010-04-23 15:49:45
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liuwei78

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by jurkat.1640 at 2010-04-23 15:46:16:
如果你插入片段的时候用单酶切，那么插入片段后就变成2个酶切位点。

插入片段是TA连接，验证时用的是单酶切
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17楼2010-04-23 15:50:36
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