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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量pcr
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greatsaint

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】荧光定量pcr已有5人参与

请问哪位能告知荧光定量PCR的时候做NTC的目的是什么？我的NTC怎么会总是污染呢？我的E=264%是怎么原因呢？怎么会这么大呢？谢谢!
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1楼2010-04-19 20:17:33
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
greatsaint(金币+1): 2010-04-19 21:14
greatsaint(金币+1):很好，谢谢 2010-04-19 21:15
amisking(金币+2): 2010-04-19 21:19
NTC和阴性对照不完全一样，拿病毒检测为例，阴性对照是指以非病毒感染样本为模板的PCR扩增，这个样本可以排除检测的不准确性，而NTC是指无模板对照，是防止操作、系统、药品等的污染，说明白这个道理，楼主应该知道做NTC的目的了吧。
我以前做病毒检测的定量PCR，发现NTC确实很容易污染，但现在做基因检测，基本不容易观测到污染现象了，这主要可能是由于质粒的气溶胶和水污染造成的，建议你PCR水常用常换，灭菌后分装，避免经常开瓶，而且要在超净台中制混合样，在超净台外加质粒、模板等
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2楼2010-04-19 20:54:54
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by yujiaping1 at 2010-04-19 20:54:54:
NTC和阴性对照不完全一样，拿病毒检测为例，阴性对照是指以非病毒感染样本为模板的PCR扩增，这个样本可以排除检测的不准确性，而NTC是指无模板对照，是防止操作、系统、药品等的污染，说明白这个道理，楼主应该知 ...

请问，我的扩增效率达到了264%是什么原因呢？怎么会这么大呢？谢谢
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3楼2010-04-19 21:45:40
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石头8832

铜虫 (小有名气)
★
scelab(金币+1):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-04-19 22:58
greatsaint(金币+1): 2010-04-20 08:58
你的目的基因可能是多拷贝的
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4楼2010-04-19 22:02:26
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greatsaint

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 石头8832 at 2010-04-19 22:02:26:
你的目的基因可能是多拷贝的

请问你这里说的多拷贝，或者单拷贝是什么意思呢？谢谢
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5楼2010-04-20 08:59:11
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主
greatsaint(金币+1): 2010-04-20 11:49
greatsaint(金币+1): 2010-04-27 10:07
NTC在普通PCR或定量PCR都是应该用的，为了就是避免环境和操作问题

但是定量出现假阳性除了这两个之外，还有考虑你的UNG酶是不是起作用了

扩增销量高也不能高到你这水平

所以肯定是有问题的

一可能是你的计算公式不对

二可能是你的加样操作有问题，导致的稀释不均

三就是你的阈值需要调整
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6楼2010-04-20 09:35:14
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sinoer

铜虫 (小有名气)
greatsaint(金币+1): 2010-04-27 10:07
你的扩增效率这么大，很明显是有非特异性扩增
建议从新设计引物
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7楼2010-04-23 16:52:39
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henka

新虫 (初入文坛)
★
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荧光定量有问题可以找toyobo。
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8楼2013-05-01 22:12:15
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nmhsd

木虫 (正式写手)
★
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NTC，一为看操作是否过关，有没有污染，如果出现了目的基因的扩增（溶解曲线峰值同目的基因一致），则说明操作不过关，换试剂，耗材，实验室。避免操作污染
二看引物本生是否容易因二级结构导致扩增，如果出现溶解曲线峰值不同于目的基因的扩增，则该换引物了。当然这个不绝对，也可提高退火温度，减少循环数等控制，视改变条件后目的基因的扩增如何决定了。
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9楼2013-05-02 11:13:57
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nmhsd

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
扩增效率有的机器是按照正常值2计算的，有的是按照1计算的。你自己用标曲斜率计算一下，与理论值差多少。
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10楼2013-05-02 11:15:57
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