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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学

[交流] 【求助/交流】麻烦大家帮忙看看非变性聚丙烯酰胺电泳图片 已有7人参与

本虫最近在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用单链构象多态性分析技术，以寻找SNP。银染结果不佳，目的条带极不清晰，无法辨别结果。恳请大家指点：
      1.PCR扩增片段为300bp，使用29：1聚丙烯酰胺原液，聚丙烯酰胺浓度为8%。使用电压300v15min，130v电压恒压13小时，1倍TBE缓冲液。
     2.上样缓冲液为去离子甲酰胺：溴酚蓝和二甲苯青=4：1，98°变性10min,冰浴5min。
     3 .染色：双蒸水漂洗两次；0.1%AgNO3，轻摇15min，弃去反应液，双蒸水漂洗两次；2%NaOH及2ml甲醛显色。
     中间的点样孔为marker,不清楚底部的亮带为何种片段？位置偏上的条带为何模糊不清？最近的电泳结果真的十分苦恼。
不知道是否有研究SSCP的讨论群及园友 ，恳请批评指点。谢谢大家的帮助！


[ Last edited by 风中摇曳 on 2010-4-24 at 13:15 ]
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scienceisnature
1楼 2010-04-16 21:57:57
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zhhard

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
西瓜(金币+2): Good！ 2011-12-12 17:10:05
西瓜: 回帖置顶 2011-12-12 17:10:17
底部的亮带是复性的，不可避免。我们实验室染色会加点甲醛750微升就可以了。
赞一下(2人) 回复此楼
8楼2011-12-11 22:24:38
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
变性胶我们一般使用19：1的，浓度也就是4.5%-6%，你这个浓度好高
另外跑变性胶，你这个电压肯定有问题，一般都是上千伏，变性胶也很少有使用氢氧化钠法显色的，一般都是碳酸钠法

你给的这个好像是非变性的做法，使用29：1的胶，浓度使用8%的胶，电压看电泳槽长度，30cm的一般300V，用氢氧化钠显色效果就不错
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-04-16 22:50:02
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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学
我用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶。现在银染技术仍需继续摸索。不知大家在非变性的聚丙烯酰胺凝胶是否用DNAmarker
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scienceisnature
3楼2010-04-17 10:57:46
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wodepower

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主可以去看下具体的银染操作，有篇文献叫Silver staining DNA in polyacrylamide gels专门讲银染的。操作过程很详细。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-03-25 20:33:45
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查看全部 8 个回答
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