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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学

[交流] 【求助/交流】麻烦大家帮忙看看非变性聚丙烯酰胺电泳图片 已有7人参与

本虫最近在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用单链构象多态性分析技术，以寻找SNP。银染结果不佳，目的条带极不清晰，无法辨别结果。恳请大家指点：
      1.PCR扩增片段为300bp，使用29：1聚丙烯酰胺原液，聚丙烯酰胺浓度为8%。使用电压300v15min，130v电压恒压13小时，1倍TBE缓冲液。
     2.上样缓冲液为去离子甲酰胺：溴酚蓝和二甲苯青=4：1，98°变性10min,冰浴5min。
     3 .染色：双蒸水漂洗两次；0.1%AgNO3，轻摇15min，弃去反应液，双蒸水漂洗两次；2%NaOH及2ml甲醛显色。
     中间的点样孔为marker,不清楚底部的亮带为何种片段？位置偏上的条带为何模糊不清？最近的电泳结果真的十分苦恼。
不知道是否有研究SSCP的讨论群及园友 ，恳请批评指点。谢谢大家的帮助！


[ Last edited by 风中摇曳 on 2010-4-24 at 13:15 ]
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scienceisnature
1楼 2010-04-16 21:57:57
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wodepower

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主可以去看下具体的银染操作，有篇文献叫Silver staining DNA in polyacrylamide gels专门讲银染的。操作过程很详细。
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4楼2011-03-25 20:33:45
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yujiaping1

木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
变性胶我们一般使用19：1的，浓度也就是4.5%-6%，你这个浓度好高
另外跑变性胶，你这个电压肯定有问题，一般都是上千伏，变性胶也很少有使用氢氧化钠法显色的，一般都是碳酸钠法

你给的这个好像是非变性的做法，使用29：1的胶，浓度使用8%的胶，电压看电泳槽长度，30cm的一般300V，用氢氧化钠显色效果就不错
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2楼2010-04-16 22:50:02
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风中摇曳

木虫 (正式写手)

热爱科学
我用的是非变性的聚丙烯酰胺凝胶。现在银染技术仍需继续摸索。不知大家在非变性的聚丙烯酰胺凝胶是否用DNAmarker
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scienceisnature
3楼2010-04-17 10:57:46
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wening

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1、你的上样量是多少？上样量过多会出现跑不好。
2、电压确定是130V吗？我们跑的是80W或120W  电压达到几千伏
3、如果是小板胶，银染过程中应该不存在冲洗时间长短对显带造成大的影响
4、聚丙烯酰胺分辨率较高，有多条带是常有的事，但从你的MARKER看出，不是样品出问题。而是电泳问题
  建议你减少上样量更试试，显色时间不宜太长。
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5楼2011-03-26 16:01:24
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