[交流] 【求助/交流】3‘RACE adapter sequence

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1楼2010-01-25 16:07:11

yujiaping1

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elliott2591(金币+1): 2010-01-29 17:35

你想求助什么，你什么地方不明白，3‘RACE产物最好是克隆测序效果好，我上次胶回收后直接测序，九个样，序列对了7个，但是只有一个测到poly（A），据说是poly（A）和胶回收对测序都有影响，所以现在又克隆送质粒了，这样测得效果可以保证

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2楼2010-01-25 16:57:30

hugang2004_2000

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amisking(金币+2): 1-25 19:36

接头序列在试剂盒说明里应该有吧。marathon的是：
5‘-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'

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3楼2010-01-25 19:25:24

yujiaping1

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哦，我才看明白。
我用的clontech的盒子
3‘RACE cDNA合成的引物是：
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'
之后用的是Universal primer A mix：
Long (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Short (2 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'

4楼2010-01-25 19:58:28

elliott2591

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回复2楼

你说poly（A）对测序有影响是什么意思？
我3‘RACE做了一个月了，有时候能够扩出条带来，但是测序总是没有poly（A）结构，我按照分子克隆上设计的接头引物，结果也没有发现接头引物！所以想换个接头引物！

5楼2010-01-26 12:48:30

yujiaping1

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引用回帖:

Originally posted by elliott2591 at 2010-01-26 12:48:30:
你说poly（A）对测序有影响是什么意思？
我3‘RACE做了一个月了，有时候能够扩出条带来，但是测序总是没有poly（A）结构，我按照分子克隆上设计的接头引物，结果也没有发现接头引物！所以想换个接头引物！

我测序的结果有的是没有Poly（A），但是对了，这就是所谓的poly（A）有影响，做TA克隆再测序就好了，但是有的没有poly（A），而且序列根本不对，那就是3‘RACE失败了，获得的片段不是目标片段，看看你属于哪种情况，后一种情况重新设计引物，就OK了。至于你说的接头，是不是就是指引物啊，关键是你的cDNA啊，是不是用来做RACE的，不光需要RACE的引物。按你目前的实验状态，强烈建议你买个进口盒子，clontech、marathon等都很好用

6楼2010-01-26 14:49:52

hugang2004_2000

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信息太少，让大家陪你猜啊？

7楼2010-01-26 15:18:09

elliott2591

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Originally posted by yujiaping1 at 2010-01-26 14:49:52:

我测序的结果有的是没有Poly（A），但是对了，这就是所谓的poly（A）有影响，做TA克隆再测序就好了，但是有的没有poly（A），而且序列根本不对，那就是3‘RACE失败了，获得的片段不是目标片段，看看你属于哪种 ...

我的主要问题就是，我按照分子克隆上设计的接头引物加poly（T），另一端是自己根据已知序列设计的特异引物，做3‘RACE，但是扩增出来的条带每次大小都不一致，送去测序发现根本就没有poly（A）或poly（T），而且特异引物也没有，序列比对不上，我估计是非特异性扩增太多了，但不知道是自己的特异引物的问题，还是接头出现非特异性扩增？所以想看看大家试剂盒里面的接头序列!

8楼2010-01-26 22:51:48

elliott2591

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此外，我也是连到T载体上送去测序的

9楼2010-01-26 22:53:04

hugang2004_2000

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Originally posted by elliott2591 at 2010-01-26 22:51:48:

我的主要问题就是，我按照分子克隆上设计的接头引物加poly（T），另一端是自己根据已知序列设计的特异引物，做3‘RACE，但是扩增出来的条带每次大小都不一致，送去测序发现根本就没有poly（A）或poly（T），而且 ...

做了这么多RACE，还没见过引物里有加PolyA或者PolyT的哈。做3‘race的时候有了特异引物之后，再用Universal Primer 或者Nested Universal primer就行了。扩出来的片段连到T载体中去测序。我觉得你说每次大小不同是因为你在引物里加了polyA 或者poly T的原因。没有这么做的哈。

10楼2010-01-28 00:52:54