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elliott2591

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】3‘RACE adapter sequence

求助3’RACE 接头序列
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by elliott2591 at 2010-01-26 22:51:48:

我的主要问题就是,我按照分子克隆上设计的接头引物加poly(T),另一端是自己根据已知序列设计的特异引物,做3‘RACE,但是扩增出来的条带每次大小都不一致,送去测序发现根本就没有poly(A)或poly(T),而且 ...

做了这么多RACE,还没见过引物里有加PolyA或者PolyT的哈。做3‘race的时候有了特异引物之后,再用Universal Primer 或者Nested Universal primer就行了。扩出来的片段连到T载体中去测序。我觉得你说每次大小不同是因为你在引物里加了polyA 或者poly T的原因。没有这么做的哈。
10楼2010-01-28 00:52:54
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查看全部 17 个回答

yujiaping1

木虫 (著名写手)

★ ★
amisking(金币+2): 1-25 19:36
elliott2591(金币+1): 2010-01-29 17:35
你想求助什么, 你什么地方不明白,3‘RACE产物最好是克隆测序效果好,我上次胶回收后直接测序,九个样,序列对了7个,但是只有一个测到poly(A),据说是poly(A)和胶回收对测序都有影响,所以现在又克隆送质粒了,这样测得效果可以保证
2楼2010-01-25 16:57:30
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hugang2004_2000

木虫 (正式写手)

★ ★
amisking(金币+2): 1-25 19:36
接头序列在试剂盒说明里应该有吧。marathon的是:
5‘-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3'
3楼2010-01-25 19:25:24
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yujiaping1

木虫 (著名写手)

哦,我才看明白。
我用的clontech的盒子
3‘RACE cDNA合成的引物是:
5'–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N–3'
之后用的是Universal primer A mix:
Long (0.4 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'
Short (2 µM):
5'–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3'
4楼2010-01-25 19:58:28
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