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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于MTT法吸光度值偏小
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1121prettycat

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于MTT法吸光度值偏小 已有4人参与

目前正在用MTT法测定细胞存活率，步骤是将培养液吸出后，加入200微升MTT，37°孵育3到4个小时，然后加入150微升DMSO，想问一下大家用的检测波长和参考波长都是多少，我目前用的是490nm的检测波长和650nm的测定波长，现在用490nm得到的吸光度值包括对照都不到0.2，大约在0.17左右，650nm检测得到的数据大约都在0.05或者0.06，不知道吸光度值偏小是因为孵育时间不够还是与细胞有关，因为使用别的细胞的时候吸光度值都没有这么小，想问一下吸光度这么小数据能否使用？
还有数据处理的时候是不是应该用各孔在490nm检测时得到的数值-650nm检测时得到的数值？
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1楼 2010-01-08 09:20:03
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★
1121prettycat(金币+1,VIP+0): 1-13 08:58
这个怎么说呢，就像核酸测浓度时用260nm，蛋白测浓度用280nm一样，是因为不同的东西有其相对应的吸光值。MTT染色测定需要用490nm，这应该也是理论中的事。

另外，5mg/L的MTT，每孔200微升，是不是有点少了，你应该接种的是96孔板，7.5万个细胞的接种量还可以，但是5mg/ml的浓度，是你配的5mg/L的1000倍，前者加20ul的话，你的应该加20ml才对，也就是说你的量不够。可以再做一次试试。

还有MTT有效期是一周，需要避光保存的。所以要注意。不过我用过避光放置一个月的（-20°C），也可以用，呵呵

祝好运
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7楼2010-01-10 11:05:44
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nicknelson

至尊木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
1121prettycat(金币+1):谢谢参与
1121prettycat(金币+1,VIP+0): 1-8 14:09
1949stone(金币+2,VIP+0): 1-8 18:04
用的细胞数量太少，或者你的细胞特殊，不适合MTT染色。
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2楼2010-01-08 11:28:32
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gaozx123

金虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
1121prettycat(金币+1):谢谢参与
amisking(金币+3,VIP+0): 1-8 17:28
请问你用的MTT是多大浓度的？怎么加200ul啊。
我用的MTT是2mg/ml的，每孔加50ul，（有的用5mg/ml，每孔加20ul），孵育3h后，加150ulDMSO溶解，用490nm和630nm测吸光值，也就是你说的检测波长与参照波长。
吸光值最好在0.2-0.8范围内，因为这个是最准确的。你测得值小，可能与接种的细胞量有关，还有就是MTT的用量。
数据处理时是需要相减的，即A490-A630。
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3楼2010-01-08 11:30:43
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1121prettycat

木虫 (正式写手)
加的5mg/L的MTT，每孔200微升，用的是原代培养的大鼠小脑颗粒神经元，接种密度7.5万，在培养1d后加药，加药1d和7d后测定
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4楼2010-01-08 14:19:05
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