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求助！！关于平末端连接问题
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最近在做载体构建，有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上，两端都是平末端，始终连不上，不知道连接体系需要怎样的优化，连接酶要多，但是一个10ul的体系中，到底要加多少酶？？？以及目的片段和载体各是多少才合适？？？？没做过，身边的人也没有经验，做的非常辛苦啊~~~ 请各位高手指点指点啊！！！谢谢 ps: 载体已经去磷酸化 [ Last edited by xuxb_4156 on 2009-9-18 at 21:17 ] |
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连接时要计算摩尔比，关键在于插入片段和载体的片段大小，比如说插入为0.5kb，20ng/ul，载体3.5kb，50ng/ul， 在都取1ul的情况下，插入和载体的摩尔比就是：1×3.5×20/（1×0.5×50）=2.8：1，通常使用的摩尔比为3：1(插入：载体)，2.8：1基本也就差不多了，并非一定要严格3：1，比如10ul体系粘性末端连接，1ul 3.5kb载体，1ul0.5kb插入，1ulT4 ligase， 1ul10×buffer,6ul H2O, 若是平端连接，酶量加倍，加1ul50%PEG4000，水适量减少即可 |
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