| 查看: 1120 | 回复: 9 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
[交流]
求助！！关于平末端连接问题
|
|||
|
最近在做载体构建，有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上，两端都是平末端，始终连不上，不知道连接体系需要怎样的优化，连接酶要多，但是一个10ul的体系中，到底要加多少酶？？？以及目的片段和载体各是多少才合适？？？？没做过，身边的人也没有经验，做的非常辛苦啊~~~ 请各位高手指点指点啊！！！谢谢 ps: 载体已经去磷酸化 [ Last edited by xuxb_4156 on 2009-9-18 at 21:17 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有49人回复
-
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有21人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有5人回复
-
国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率
已经有8人回复
-
各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。
已经有7人回复
-
filecode
已经有10人回复
-
奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样
已经有11人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有8人回复
-
应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键
已经有37人回复
-
好奇怪的filecode
已经有7人回复
jessica533
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 385.2
- 散金: 17
- 帖子: 140
- 在线: 84.1小时
- 虫号: 830054
- 注册: 2009-08-18
- 性别: MM
- 专业: 生物大分子结构与功能
2楼2009-09-18 19:15:27
charlies929
至尊木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 金币: 16308.8
- 散金: 50
- 红花: 11
- 帖子: 940
- 在线: 149.2小时
- 虫号: 465261
- 注册: 2007-11-22
- 性别: GG
- 专业: 环境化学
3楼2009-09-18 20:21:27
4楼2009-09-18 21:13:46
5楼2009-09-18 22:23:37
zhuifeng7000
至尊木虫 (著名写手)
- BioEPI: 1
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 16811.1
- 散金: 32
- 红花: 3
- 帖子: 2034
- 在线: 88.2小时
- 虫号: 598143
- 注册: 2008-09-10
- 专业: 微生物生理与生物化学
6楼2009-09-18 22:31:46
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- BioEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
7楼2009-09-19 08:58:48
8楼2009-09-19 10:51:24
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
|
连接时要计算摩尔比，关键在于插入片段和载体的片段大小，比如说插入为0.5kb，20ng/ul，载体3.5kb，50ng/ul， 在都取1ul的情况下，插入和载体的摩尔比就是：1×3.5×20/（1×0.5×50）=2.8：1，通常使用的摩尔比为3：1(插入：载体)，2.8：1基本也就差不多了，并非一定要严格3：1，比如10ul体系粘性末端连接，1ul 3.5kb载体，1ul0.5kb插入，1ulT4 ligase， 1ul10×buffer,6ul H2O, 若是平端连接，酶量加倍，加1ul50%PEG4000，水适量减少即可 |
9楼2009-09-19 12:17:34
beisimai895
木虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 4456.6
- 帖子: 231
- 在线: 191.5小时
- 虫号: 513938
- 注册: 2008-02-28
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
10楼2009-09-19 16:21:27
