24小时热门版块排行榜    

查看: 1129  |  回复: 9
当前主题已经存档。
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

xuxb_4156

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助!!关于平末端连接问题

最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知道连接体系需要怎样的优化,连接酶要多,但是一个10ul的体系中,到底要加多少酶???以及目的片段和载体各是多少才合适????没做过,身边的人也没有经验,做的非常辛苦啊~~~
请各位高手指点指点啊!!!谢谢
ps: 载体已经去磷酸化

[ Last edited by xuxb_4156 on 2009-9-18 at 21:17 ]
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuxb_4156

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by wangxiaoli8216 at 2009-9-18 21:13:
载体去磷酸化

已经去磷酸化了,连了几次都只有几个斑,而且不是重组子
5楼2009-09-18 22:23:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

jessica533

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2,VIP+0): 9-18 22:33
平末端连接可以加1ul酶,另外建议通过在凝胶成像系统下对载体和插入片段定量,再根据载体和插入片段的分子量,计算出载体与插入片段的摩尔比为3:1时的体积比,载体和插入片段共8ul。
把忧愁微掉,将快乐积起。
2楼2009-09-18 19:15:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

charlies929

至尊木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 9-18 22:33
我常常用Fermentas的酶做链接的,1ulT4, 1ul Buffer, 1ul PEG4000,剩下的两个片段摩尔比1:1,16度过夜转化Top10,应该没有问题的。
3楼2009-09-18 20:21:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 9-18 22:34
我觉得平端连的话片段和酶的量一定要加大,正常粘性末端连接的话,片段与质粒的量之比为2:1-3:1,平端的话要10:1。10ul体系,1~1.5ul酶就够了(Fermentas)。转化时一定要做阴性对照!
6楼2009-09-18 22:31:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI文章,我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 7lpolszZVXgi 2026-08-14 6/300 2026-08-15 04:21 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的,真有人买论文么?感觉没必要啊 +11 Tide man 2026-08-10 12/600 2026-08-15 02:12 by home3163
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 22/1100 2026-08-14 23:45 by Noways
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果? +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[基金申请] 奇怪,两个人的filecode固定段从头到尾一模一样 +8 布布和一二 2026-08-10 11/550 2026-08-14 14:58 by Equinoxhua
[硕博家园] 请教兼职经验 +3 是阿文鸭 2026-08-09 3/150 2026-08-14 12:07 by HER12025
[论文投稿] 职称评审,求友友推荐见刊最快的期刊 +5 工厂打螺丝 2026-08-08 5/250 2026-08-14 11:03 by 玖戈弋
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 我的国基提前知道中了,可是同事的操作让我实在接受不了,怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +9 majunge000 2026-08-10 12/600 2026-08-13 23:20 by iwuli
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能,周易传统文化,filecode打分制来了,3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见,大家看看几个A,几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 什么时候出结果,有咨询渠道??? +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了,国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] fileCode有新解读? +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
信息提示
请填处理意见