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xuxb_4156

新虫 (初入文坛)

[交流] 求助!!关于平末端连接问题

最近在做载体构建,有一个5k左右的片段要连接到一个12k左右的载体骨架上,两端都是平末端,始终连不上,不知道连接体系需要怎样的优化,连接酶要多,但是一个10ul的体系中,到底要加多少酶???以及目的片段和载体各是多少才合适????没做过,身边的人也没有经验,做的非常辛苦啊~~~
请各位高手指点指点啊!!!谢谢
ps: 载体已经去磷酸化

[ Last edited by xuxb_4156 on 2009-9-18 at 21:17 ]
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寒山拾得

木虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
普通引物合成5‘是羟基,你要加上磷酸合成引物,载体去磷酸化,才能连上,同时防止自连。引物和载体同时去磷酸化是连不上的。你可以载体不去磷酸化试试,可能链接效率低点。不过可以PCR菌落筛选。
8楼2009-09-19 10:51:24
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jessica533

新虫 (小有名气)

★ ★ ★
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amisking(金币+2,VIP+0): 9-18 22:33
平末端连接可以加1ul酶,另外建议通过在凝胶成像系统下对载体和插入片段定量,再根据载体和插入片段的分子量,计算出载体与插入片段的摩尔比为3:1时的体积比,载体和插入片段共8ul。
把忧愁微掉,将快乐积起。
2楼2009-09-18 19:15:27
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charlies929

至尊木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+1,VIP+0): 9-18 22:33
我常常用Fermentas的酶做链接的,1ulT4, 1ul Buffer, 1ul PEG4000,剩下的两个片段摩尔比1:1,16度过夜转化Top10,应该没有问题的。
3楼2009-09-18 20:21:27
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xuxb_4156

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by wangxiaoli8216 at 2009-9-18 21:13:
载体去磷酸化

已经去磷酸化了,连了几次都只有几个斑,而且不是重组子
5楼2009-09-18 22:23:37
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