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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进?
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小千100

新虫 (小有名气)

[求助] 同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与

使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。
1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。
2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl
3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。
4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少）
5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。
6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl.

@wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2019-07-24 09:57:52
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小千100

新虫 (小有名气)
希望各位老师可以帮忙我指出问题，我重新做，刚入门不久的小白，谢谢大家了

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2楼2019-07-24 10:02:34
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-07-24 18:02:51
有一个问题呀，你的阴性对照不加片段或者载体应该不会形成环状质粒，怎么会长出菌落呢？另外，你可以试一下将三个片段通过PCR连接起来再克隆到载体上。诺唯赞来我们这推销过这个试剂盒，我觉得没有什么优势，即使你现在克隆上了，还是要切下来，再进行后续的酶切连接，并没有省事。个人建议。
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3楼2019-07-24 12:13:01
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匿名

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4楼2019-07-27 18:40:00
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prthefu

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小千100(渊博震天代发): 金币+20, 鼓励积极回帖 2019-08-11 15:21:03
你是要做原核菌的同源重组吗？我这两天也刚查这方面的资料，简单说一下我的见解，仅供交流。
三片段各自扩增好后，先进行连接，然后再把融合好的打靶片段通过TA克隆链接到载体上，转入目的菌后进行筛选就可以。
大体流程是这样，说着不难，但确实是做的过程中会有很多问题。
你上面提到的疑惑，多片段和载体共同连接转化后，没什么单菌落，那可能是连接效率不太好。
另外，你挑了单克隆摇菌提质粒，再双酶切，是什么目的呢？连上了为什么又要切开？
最后，你所谓的阴性对照1只加了载体，你指的是线性化的载体吗？那不应该会长菌啊。如果是空载，是会有正常菌落的。
                       阴性对照2是加入了三个基因片段，理论上也不会长菌啊，为什么你的也有呢？
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nothing is impossible in this world，if you have the will to win，you can achieve anything
5楼2019-08-06 15:42:27
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小千100

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2019-07-24 12:13:01
有一个问题呀，你的阴性对照不加片段或者载体应该不会形成环状质粒，怎么会长出菌落呢？另外，你可以试一下将三个片段通过PCR连接起来再克隆到载体上。诺唯赞来我们这推销过这个试剂盒，我觉得没有什么优势，即使你 ...

谢谢你的解答。后面我咨询了技术，说可能是原本我的载体就没有切开，阴性对照加入片段长菌的可能是其中一个片段扩增用的模板残留，这个模板质粒含有同样的抗性，其实我也不清楚，后面我重新酶切了载体，重新操作了一遍，连接成功了，也是神奇

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6楼2019-08-06 19:04:15
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小千100

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by prthefu at 2019-08-06 15:42:27
你是要做原核菌的同源重组吗？我这两天也刚查这方面的资料，简单说一下我的见解，仅供交流。
三片段各自扩增好后，先进行连接，然后再把融合好的打靶片段通过TA克隆链接到载体上，转入目的菌后进行筛选就可以。
大 ...

嗯嗯，也有同学推荐我那么做，后面我重新这样操作连接成功了。阴性对照1是只加了线性化载体，长单菌落可能是我没有切开；阴性对照2只加片段长菌可能是我其中一个片段用的扩增模板残留了，那个质粒模板具有相同抗性。

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7楼2019-08-06 19:09:57
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小千100

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 大-木-虫 at 2019-07-27 18:40:00
多片段重组有一个效率问题，你的片段差别比较大，也会影响效率，只要按照标准体系做的，理论上就没问题，成不成的就看运气了，所谓的多片段也并没有说的那么神奇，在保证同源臂设计正确，长度足够的情况下，只能重复 ...

是的，我觉得有时候碰运气，后面我重复了就连成了，具体哪里问题我也不清楚。还有一个问题就是我其中一个酶切位点上下游GC含量偏低，没达到说明书中的40%-60%之间。这个应该也是一个因素影响连接效率，总之严格按说明书的来应该不会错的。

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8楼2019-08-06 19:14:38
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匿名

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9楼2019-08-06 20:01:12
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科研happy

新虫 (著名写手)
您好，我也用的诺唯赞的酶，同时试了单片段连接和多片段连接，不管我换哪个感受态细胞，不管我加多少，都不长菌，求大神指教

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10楼2019-08-10 10:26:59
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