| 查看: 9034 | 回复: 9 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与
|
||
|
使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。 1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。 2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl 3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。 4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少） 5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。 6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有268人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
匿名
用户注销 (正式写手)
- 应助: 128 (高中生)
- 金币: 4550.4
- 散金: 50
- 红花: 22
- 帖子: 934
- 在线: 645.1小时
- 虫号: 0
- 注册: 2011-10-17
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
4楼2019-07-27 18:40:00
2楼2019-07-24 10:02:34
xinxiyuzhou
至尊木虫 (著名写手)
- 应助: 78 (初中生)
- 金币: 13452.5
- 散金: 55
- 红花: 19
- 帖子: 2045
- 在线: 425小时
- 虫号: 1304974
- 注册: 2011-05-24
- 性别: GG
- 专业: 神经生物学
3楼2019-07-24 12:13:01
prthefu
木虫 (著名写手)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 2573.9
- 散金: 81
- 红花: 14
- 沙发: 1
- 帖子: 1551
- 在线: 187小时
- 虫号: 3083070
- 注册: 2014-03-24
- 性别: MM
- 专业: 生物海洋学与海洋生物资源
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小千100(渊博震天代发): 金币+20, 鼓励积极回帖 2019-08-11 15:21:03
小千100(渊博震天代发): 金币+20, 鼓励积极回帖 2019-08-11 15:21:03
|
你是要做原核菌的同源重组吗？我这两天也刚查这方面的资料，简单说一下我的见解，仅供交流。 三片段各自扩增好后，先进行连接，然后再把融合好的打靶片段通过TA克隆链接到载体上，转入目的菌后进行筛选就可以。 大体流程是这样，说着不难，但确实是做的过程中会有很多问题。 你上面提到的疑惑，多片段和载体共同连接转化后，没什么单菌落，那可能是连接效率不太好。 另外，你挑了单克隆摇菌提质粒，再双酶切，是什么目的呢？连上了为什么又要切开？ 最后，你所谓的阴性对照1只加了载体，你指的是线性化的载体吗？那不应该会长菌啊。如果是空载，是会有正常菌落的。 阴性对照2是加入了三个基因片段，理论上也不会长菌啊，为什么你的也有呢？ |
5楼2019-08-06 15:42:27
