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同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与
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使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。 1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。 2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl 3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。 4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少） 5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。 6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2019-07-24 10:02:34
xinxiyuzhou
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4楼2019-07-27 18:40:00
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小千100(渊博震天代发): 金币+20, 鼓励积极回帖 2019-08-11 15:21:03
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你是要做原核菌的同源重组吗？我这两天也刚查这方面的资料，简单说一下我的见解，仅供交流。 三片段各自扩增好后，先进行连接，然后再把融合好的打靶片段通过TA克隆链接到载体上，转入目的菌后进行筛选就可以。 大体流程是这样，说着不难，但确实是做的过程中会有很多问题。 你上面提到的疑惑，多片段和载体共同连接转化后，没什么单菌落，那可能是连接效率不太好。 另外，你挑了单克隆摇菌提质粒，再双酶切，是什么目的呢？连上了为什么又要切开？ 最后，你所谓的阴性对照1只加了载体，你指的是线性化的载体吗？那不应该会长菌啊。如果是空载，是会有正常菌落的。 阴性对照2是加入了三个基因片段，理论上也不会长菌啊，为什么你的也有呢？ |
5楼2019-08-06 15:42:27
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谢谢你的解答。后面我咨询了技术，说可能是原本我的载体就没有切开，阴性对照加入片段长菌的可能是其中一个片段扩增用的模板残留，这个模板质粒含有同样的抗性，其实我也不清楚，后面我重新酶切了载体，重新操作了一遍，连接成功了，也是神奇  发自小木虫Android客户端 |
6楼2019-08-06 19:04:15
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嗯嗯，也有同学推荐我那么做，后面我重新这样操作连接成功了。阴性对照1是只加了线性化载体，长单菌落可能是我没有切开；阴性对照2只加片段长菌可能是我其中一个片段用的扩增模板残留了，那个质粒模板具有相同抗性。 发自小木虫Android客户端 |
7楼2019-08-06 19:09:57
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是的，我觉得有时候碰运气，后面我重复了就连成了，具体哪里问题我也不清楚。还有一个问题就是我其中一个酶切位点上下游GC含量偏低，没达到说明书中的40%-60%之间。这个应该也是一个因素影响连接效率，总之严格按说明书的来应该不会错的。 发自小木虫Android客户端 |
8楼2019-08-06 19:14:38
匿名
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