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小千100

新虫 (小有名气)

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[求助] 同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与

使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。
1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。
2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl
3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。
4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少）
5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。
6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl.

@wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端

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1楼 2019-07-24 09:57:52

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新虫 (小有名气)

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引用回帖:

5楼: Originally posted by prthefu at 2019-08-06 15:42:27
你是要做原核菌的同源重组吗？我这两天也刚查这方面的资料，简单说一下我的见解，仅供交流。
三片段各自扩增好后，先进行连接，然后再把融合好的打靶片段通过TA克隆链接到载体上，转入目的菌后进行筛选就可以。
大 ...

嗯嗯，也有同学推荐我那么做，后面我重新这样操作连接成功了。阴性对照1是只加了线性化载体，长单菌落可能是我没有切开；阴性对照2只加片段长菌可能是我其中一个片段用的扩增模板残留了，那个质粒模板具有相同抗性。

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