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同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与
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使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。 1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。 2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl 3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。 4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少） 5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。 6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl. @wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端 |
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谢谢你的解答。后面我咨询了技术，说可能是原本我的载体就没有切开，阴性对照加入片段长菌的可能是其中一个片段扩增用的模板残留，这个模板质粒含有同样的抗性，其实我也不清楚，后面我重新酶切了载体，重新操作了一遍，连接成功了，也是神奇  发自小木虫Android客户端 |
6楼2019-08-06 19:04:15
2楼2019-07-24 10:02:34
xinxiyuzhou
至尊木虫 (著名写手)
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3楼2019-07-24 12:13:01
匿名
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4楼2019-07-27 18:40:00
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