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小千100

新虫 (小有名气)

[求助] 同源重组多片段连接做不出来，我想重新做但又不知道是哪里操作的问题，怎么改进? 已有3人参与

使用的是诺维赞多片段连接试剂盒，引物用公司的在线软件设计的。载体8000多bp，三个片段分别1019，381，250多。
1.载体用takara快切酶双酶切30min，切胶回收，目的片段分别以之前的2个T载体扩增，一个质粒扩增，切胶回收。
2.分别稀释跑胶估算载体、三个片段浓度，按片段长度计算大致每个片段需要多少ng，加入多少μl
3.按说明书分别加入4μl载体，三个片段2μl，1μl，1μl，酶和buffer分别2μl，4μl，总体积20μl。37度反应30min。
4.10μl重组产物转化100μl大肠杆菌感受态，过夜培养挑单菌落（比较少）
5.挑了9个单菌落摇菌提了质粒，双酶切都没有切出片段。
6.同时我做了两个阴性对照1和2，都长了很多单菌落。1是只加了载体4μl，加水至20μl.2是只加了三个片段，加水至20μl.

@wizardfan @youlinglyw @biostar2009 发自小木虫Android客户端
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1楼 2019-07-24 09:57:52
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科研happy

新虫 (著名写手)
您好，我也用的诺唯赞的酶，同时试了单片段连接和多片段连接，不管我换哪个感受态细胞，不管我加多少，都不长菌，求大神指教

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10楼2019-08-10 10:26:59
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小千100

新虫 (小有名气)
希望各位老师可以帮忙我指出问题，我重新做，刚入门不久的小白，谢谢大家了

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2楼2019-07-24 10:02:34
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-07-24 18:02:51
有一个问题呀，你的阴性对照不加片段或者载体应该不会形成环状质粒，怎么会长出菌落呢？另外，你可以试一下将三个片段通过PCR连接起来再克隆到载体上。诺唯赞来我们这推销过这个试剂盒，我觉得没有什么优势，即使你现在克隆上了，还是要切下来，再进行后续的酶切连接，并没有省事。个人建议。
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3楼2019-07-24 12:13:01
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匿名

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4楼2019-07-27 18:40:00
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