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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 原核表达如何确定有表达
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pc1453

金虫 (小有名气)

[求助] 原核表达如何确定有表达 已有3人参与

原核表达过程中已经测序正确了，预试验的胶图上预测蛋白大小处没有明显条带，这时该如何判断是否有表达呢，又该如何确定表达的位置以及实际的蛋白大小呢
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1楼 2019-01-21 10:19:21
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melyliang

新虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-04-21 22:46:11
有标签的话可以做个western

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4楼2019-01-21 17:01:21
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1034714749

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-02-14 20:33:34
不表达也是可能的，遇到过很多次类似情况，大部分通过以下方式解决了，希望有所帮助。
1，是否注意基因来源，密码子是否优化过？
2，蛋白胶毕竟只是定性，建议做个western验证下
3，优化一下诱导条件，
4，换一个表达载体试试
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8楼2019-01-23 10:21:31
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普通回帖

wuhu0612331

铜虫 (正式写手)
那就是没有了

发自小木虫Android客户端
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2楼2019-01-21 10:49:19
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pc1453

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wuhu0612331 at 2019-01-21 10:49:19
那就是没有了

测序也正确，确定带有目的基因的质粒也转化进去了，怎么会没有表达呢
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3楼2019-01-21 13:19:33
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Jona_0814

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
pc1453(渊博震天代发): 金币+3, 鼓励积极回帖 2019-01-22 14:41:33
从你的描述看，应该是没有表达。
你可以调整一下诱导表达的条件。
另外，你在蛋白胶上点的样只是上清吗？有的蛋白可以不是可溶性表达。把全菌和上清一起跑个胶。对比多出来哪个条带。
蛋白大小一般都是根据氨基酸序列预测就可了。
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5楼2019-01-22 11:20:43
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pc1453

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Jona_0814 at 2019-01-22 11:20:43
从你的描述看，应该是没有表达。
你可以调整一下诱导表达的条件。
另外，你在蛋白胶上点的样只是上清吗？有的蛋白可以不是可溶性表达。把全菌和上清一起跑个胶。对比多出来哪个条带。
蛋白大小一般都是根据氨基酸 ...

蛋白胶上上的样包括了上清，破碎后的全蛋白，还有沉淀了，以及空载对照处理组也一起跑了，没有明显条带。
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6楼2019-01-23 08:49:01
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Jona_0814

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2019-02-14 20:33:16
引用回帖:
6楼: Originally posted by pc1453 at 2019-01-23 08:49:01
蛋白胶上上的样包括了上清，破碎后的全蛋白，还有沉淀了，以及空载对照处理组也一起跑了，没有明显条带。...

有没有比空载多出来一条带呢？（你做对照了吗？）
如果没有的话，应该是蛋白没有被诱导表达出来。
调整一下诱导温度，诱导剂量登。你可以先小量诱导，摸索下条件。
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7楼2019-01-23 10:06:15
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pc1453

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Jona_0814 at 2019-01-23 10:06:15
有没有比空载多出来一条带呢？（你做对照了吗？）
如果没有的话，应该是蛋白没有被诱导表达出来。
调整一下诱导温度，诱导剂量登。你可以先小量诱导，摸索下条件。...

没有多出来一条带。
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9楼2019-01-23 10:48:35
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pc1453

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 1034714749 at 2019-01-23 10:21:31
不表达也是可能的，遇到过很多次类似情况，大部分通过以下方式解决了，希望有所帮助。
1，是否注意基因来源，密码子是否优化过？
2，蛋白胶毕竟只是定性，建议做个western验证下
3，优化一下诱导条件，
4，换一 ...

这是新换的载体，诱导条件是用之前的条件，还有必要再试一次吗
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10楼2019-01-23 10:50:55
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