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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计引物遇到难题
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林小露

铜虫 (小有名气)

[求助] 设计引物遇到难题 已有3人参与

本人扩增的序列为946bp，21-608为CDS，以下为基因序列；

        1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta

       61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag

      121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg

      181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc

      241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc

      301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag

      361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc

      421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct

      481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact

      541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta

      601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt

      661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac

      721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa

      781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac

      841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact

      901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc

用pp5设计引物，设计条件上游引物在1-20bp内，下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，条件很不好，不懂的应该怎么改条件，按照网上的说法改了条件还是不好，求大神赐教！！！
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1楼 2017-10-12 15:37:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

育种小飞

新虫 (初入文坛)
扩基因全长，分两种情况，如果是从质粒中扩，引物直接取起始密码子和终止密码子，如果从cDNA中扩，那就必须在utr区设计引物，

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29楼2017-10-15 15:09:56
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
随便帮你选了一段序列，具体可以参照NCBI上的在线软件
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/too ... enH61LOZlpB7Ldr8Dyg
设计引物遇到难题
大.png
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14楼2017-10-13 12:03:53
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 17:33:08
我是想采用酶切法得到扩增后的目的基因进行表达，如果需要使用酶切法，设计引物一定要从密码子开始设计引物吗？那下游引物也要设计在终止密码子前面咯？...

嗯，如果不做融合蛋白，就加上终止密码子，如果做融合蛋白，就去掉终止密码子。

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不是优秀，而是不可替代
17楼2017-10-13 19:01:42
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 20:01:16
如果我要用酶切法。然后引物设计在起始密码子和终止密码子两侧，这样可以吗/，因为设计在两侧的引物条件貌似比在起始、终止密码子上设计的引物好一点...

如果用酶切法做，还要加酶切位点和保护碱基，设计好后单条引物长度不要大于35bp就行，设计这种载体引物不用考虑那么多，设计出来试就可以了。另外载体引物一般不会像你说的在两侧设计……

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不是优秀，而是不可替代
23楼2017-10-13 22:25:25
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-14 09:00:11
那么设计出来后两者的Tm值相差太大的话，PCR中的温度应该如何设置呢？
...

这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位点，或者保护碱基换成G或C

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不是优秀，而是不可替代
28楼2017-10-14 22:55:32
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-15 21:08:57
我的原模版是提取mRNA反转得到的CDNA，也可以用这个方法的是吗？
...

这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试，有非特异扩增就继续加温度。

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32楼2017-10-16 00:20:01
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普通回帖

匿名

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2楼2017-10-12 17:26:21
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 17:26:21
可以长一点，保证两条引物的TM值相差在5度以内

谢谢您的回复啊。本人是新手，这个一整段基因序列长度就是946bp，我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢？不懂
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3楼2017-10-12 20:04:20
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晋鹏

版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-13 07:49:10
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢？

直接P全长就好了。
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及时行乐，人生不留遗憾！
4楼2017-10-12 20:49:15
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匿名

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5楼2017-10-12 22:18:15
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wareer

铜虫 (小有名气)
上下游直接取，只要Tm相近即可，不用管长度

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6楼2017-10-12 22:39:57
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didongwei

金虫 (著名写手)
你上游引物在1一20bp选？那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么？

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7楼2017-10-12 23:12:58
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 晋鹏 at 2017-10-12 20:49:15
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢？

直接P全长就好了。

有了CDS就不用引物了吗？PCR不都要引物吗？我目的就是想要全长，求大神赐教

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8楼2017-10-13 09:28:43
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 22:18:15
引物的长度呀，不是基因的长度
...

哦哦哦哦，21位开始就是起始密码子，我看到有些文章上面说要克隆全长引物就要设置在起始密码子前面，不太懂原理，求赐教

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9楼2017-10-13 09:30:46
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-12 23:12:58
你上游引物在1一20bp选？那基本上是没得选呀。你的实验目的是什么？

我的目的是克隆一整段基因序列然后成功表达，求大神赐教

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10楼2017-10-13 09:31:47
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