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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计引物遇到难题
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
29楼: Originally posted by 育种小飞 at 2017-10-15 15:09:56
扩基因全长，分两种情况，如果是从质粒中扩，引物直接取起始密码子和终止密码子，如果从cDNA中扩，那就必须在utr区设计引物，

从质粒开始扩是什么意思？本人新手，不是很懂啊，我的目的是想克隆一个动物蛋白的基因，提取mRNA反转得到CDNA为模版，再进行PCR扩增，表达蛋白，请大神指教！

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31楼2017-10-15 21:11:42
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-15 21:08:57
我的原模版是提取mRNA反转得到的CDNA，也可以用这个方法的是吗？
...

这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试，有非特异扩增就继续加温度。

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不是优秀，而是不可替代
32楼2017-10-16 00:20:01
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
32楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-16 00:20:01
这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试，有非特异扩增就继续加温度。
...

那设计好的引物的Tm值，是不是包括酶切位点，保护碱基和起始密码子开始20个在内一起的Tm值，还是说只是起始密码子20个碱基序列的Tm值呢？

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33楼2017-10-16 22:11:46
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
33楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-16 22:11:46
那设计好的引物的Tm值，是不是包括酶切位点，保护碱基和起始密码子开始20个在内一起的Tm值，还是说只是起始密码子20个碱基序列的Tm值呢？
...

这个你不用算，引物单子上会有准确的温度的

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不是优秀，而是不可替代
34楼2017-10-16 22:22:33
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
34楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-16 22:22:33
这个你不用算，引物单子上会有准确的温度的
...

非常感谢您！！！

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35楼2017-10-17 14:11:12
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shaozi1030
36楼2017-10-18 14:45:11
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cifer1230

金虫 (著名写手)

cifer1230
引用回帖:
28楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-14 22:55:32
这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位 ...

你好，我想问您个问题，我p的那个基因，原来55度什么带都没，53度发现有二聚体，51度也是只有二聚体，52度也是只有二聚体，我应该怎么调呢？
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.....
37楼2017-10-18 17:42:10
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卡卡罗特zxg

金虫 (小有名气)
能扩增出来了就可以  然后胶回收纯化   引物设计没关系的

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38楼2017-10-18 18:20:14
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
37楼: Originally posted by cifer1230 at 2017-10-18 17:42:10
你好，我想问您个问题，我p的那个基因，原来55度什么带都没，53度发现有二聚体，51度也是只有二聚体，52度也是只有二聚体，我应该怎么调呢？...

如果确定模板没有问题的条件下，用54度试试，另外你用的是高保真酶吗？高保真酶对模板要求比较高

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不是优秀，而是不可替代
39楼2017-10-18 21:58:39
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