24小时热门版块排行榜    

查看: 1998  |  回复: 38

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
29楼: Originally posted by 育种小飞 at 2017-10-15 15:09:56
扩基因全长,分两种情况,如果是从质粒中扩,引物直接取起始密码子和终止密码子,如果从cDNA中扩,那就必须在utr区设计引物,

从质粒开始扩是什么意思?本人新手,不是很懂啊,我的目的是想克隆一个动物蛋白的基因,提取mRNA反转得到CDNA为模版,再进行PCR扩增,表达蛋白,请大神指教!

发自小木虫IOS客户端
31楼2017-10-15 21:11:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
30楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-15 21:08:57
我的原模版是提取mRNA反转得到的CDNA,也可以用这个方法的是吗?
...

这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试,有非特异扩增就继续加温度。

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
32楼2017-10-16 00:20:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
32楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-16 00:20:01
这个可以的……先以最低Tm为基础减1到2度试,有非特异扩增就继续加温度。
...

那设计好的引物的Tm值,是不是包括酶切位点,保护碱基和起始密码子开始20个在内一起的Tm值,还是说只是起始密码子20个碱基序列的Tm值呢?

发自小木虫IOS客户端
33楼2017-10-16 22:11:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
33楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-16 22:11:46
那设计好的引物的Tm值,是不是包括酶切位点,保护碱基和起始密码子开始20个在内一起的Tm值,还是说只是起始密码子20个碱基序列的Tm值呢?
...

这个你不用算,引物单子上会有准确的温度的

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
34楼2017-10-16 22:22:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

林小露

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
34楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-16 22:22:33
这个你不用算,引物单子上会有准确的温度的
...

非常感谢您!!!

发自小木虫IOS客户端
35楼2017-10-17 14:11:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
36楼2017-10-18 14:45:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cifer1230

金虫 (著名写手)

cifer1230

引用回帖:
28楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-14 22:55:32
这个要试,一般先以低的那个作参考,在其基础上降低1到2度,然后扩增,如果没有杂带就可以,如果有杂带就逐渐提高温度,直至没有杂带为止,如果温度调到扩增不出来,也还是没有合适温度就更换引物,主要是换酶切位 ...

你好,我想问您个问题,我p的那个基因,原来55度什么带都没,53度发现有二聚体,51度也是只有二聚体,52度也是只有二聚体,我应该怎么调呢?
.....
37楼2017-10-18 17:42:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

卡卡罗特zxg

金虫 (小有名气)

能扩增出来了就可以  然后胶回收纯化   引物设计没关系的

发自小木虫Android客户端
38楼2017-10-18 18:20:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
37楼: Originally posted by cifer1230 at 2017-10-18 17:42:10
你好,我想问您个问题,我p的那个基因,原来55度什么带都没,53度发现有二聚体,51度也是只有二聚体,52度也是只有二聚体,我应该怎么调呢?...

如果确定模板没有问题的条件下,用54度试试,另外你用的是高保真酶吗?高保真酶对模板要求比较高

发自小木虫IOS客户端
不是优秀,而是不可替代
39楼2017-10-18 21:58:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 林小露 的主题更新
信息提示
请填处理意见