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林小露

铜虫 (小有名气)

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虫号: 5239513
注册: 2016-11-15
性别: MM
专业: 生物物理、生物化学与分子

[求助] 设计引物遇到难题已有3人参与

本人扩增的序列为946bp，21-608为CDS，以下为基因序列；

      1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta

   61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag

   121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg

   181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc

   241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc

   301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag

   361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc

   421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct

   481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact

   541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta

   601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt

   661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac

   721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa

   781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac

   841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact

   901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc

用pp5设计引物，设计条件上游引物在1-20bp内，下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，条件很不好，不懂的应该怎么改条件，按照网上的说法改了条件还是不好，求大神赐教！！！

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1楼 2017-10-12 15:37:02

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cifer1230

金虫 (著名写手)

cifer1230

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专业: 无机材料化学

引用回帖:

28楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-14 22:55:32
这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位 ...

你好，我想问您个问题，我p的那个基因，原来55度什么带都没，53度发现有二聚体，51度也是只有二聚体，52度也是只有二聚体，我应该怎么调呢？