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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计引物遇到难题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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林小露

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

[求助] 设计引物遇到难题 已有3人参与

本人扩增的序列为946bp，21-608为CDS，以下为基因序列；

        1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta

       61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag

      121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg

      181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc

      241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc

      301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag

      361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc

      421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct

      481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact

      541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta

      601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt

      661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac

      721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa

      781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac

      841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact

      901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc

用pp5设计引物，设计条件上游引物在1-20bp内，下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，条件很不好，不懂的应该怎么改条件，按照网上的说法改了条件还是不好，求大神赐教！！！
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1楼 2017-10-12 15:37:02
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cifer1230

管理员

cifer1230

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
28楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-14 22:55:32
这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位 ...

你好，我想问您个问题，我p的那个基因，原来55度什么带都没，53度发现有二聚体，51度也是只有二聚体，52度也是只有二聚体，我应该怎么调呢？
赞一下 回复此楼
.....
37楼2017-10-18 17:42:10
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匿名

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
本帖仅楼主可见
赞一下
2楼2017-10-12 17:26:21
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林小露

主管区长

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
2楼: Originally posted by kentyu at 2017-10-12 17:26:21
可以长一点，保证两条引物的TM值相差在5度以内

谢谢您的回复啊。本人是新手，这个一整段基因序列长度就是946bp，我是想扩增出来表达蛋白质的。请问如何长一点呢？不懂
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3楼2017-10-12 20:04:20
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晋鹏

禁虫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-10-13 07:49:10
如果已经有CDS。
为什么还需要引物呢？

直接P全长就好了。
赞一下 回复此楼
及时行乐，人生不留遗憾！
4楼2017-10-12 20:49:15
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