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林小露铜虫 (小有名气)
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设计引物遇到难题已有3人参与
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本人扩增的序列为946bp，21-608为CDS，以下为基因序列； 1 agaagaaccc gacaccagaa atggagaaga aattgtttgg tatcgcttta ctcttaacta 61 ctgtagcctc agttttggcc gccgatacaa acgccccaat atgtctttgt gacgagccag 121 gagttctagg acggactcag atcgtgacga cggagattaa agataagatc gagaaagctg 181 tcgaagctgt tgcacaagag agtggtgtat caggaagagg attttctata ttttctcatc 241 atcctgtgtt cagggaatgt ggcaaatacg agtgtcgaac cgtgaggcct gaacacagcc 301 gttgctataa ctttcccccg tttattcatt tcaagtcaga atgccctgtt tcaactcgag 361 actgtgagcc agtatttggt tatacggtag caggagagtt tagggttatt gtacaggctc 421 caagggctgg gtttagacag tgtgtgtggc aacataagtg tcgattcggt agtaacagct 481 gtggttataa tgggaggtgt actcagcaga ggtcagtggt tcgtttggtg acctacaact 541 tggagaaaga cggtttcttg tgtgaaagct tccgaacatg ctgtggttgt ccttgtcgta 601 gtttttaagc ctaactcatg ggttttagtt cttaagtcta actcattaag actaaattgt 661 taagccaaac tcatgagttt agacacaagg attattcagt actatctttg caaatattac 721 tttttgattg ttagtttcga caaattaacg atgcttgttc aaattttaaa accttctaaa 781 ctacagaact aacattcagt aaaatataat ttgatttcgt aattacaata agaacgtaac 841 atgtattgtt atcaccttct ccatccaatc attttttata ctctgtatga ataaaatact 901 gtatggaatg tactttgtac aataaagtta aatatatatc tatgcc 用pp5设计引物，设计条件上游引物在1-20bp内，下游引物在609-946bp内。引物长度在18-21内均试过，得到的上下游引物Tm值相差非常大，上下游引物的GC含量相差也很大，条件很不好，不懂的应该怎么改条件，按照网上的说法改了条件还是不好，求大神赐教！！！ |
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29楼2017-10-15 15:09:56
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随便帮你选了一段序列，具体可以参照NCBI上的在线软件 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/too ... enH61LOZlpB7Ldr8Dyg  大.png |
14楼2017-10-13 12:03:53
didongwei
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17楼2017-10-13 19:01:42
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如果用酶切法做，还要加酶切位点和保护碱基，设计好后单条引物长度不要大于35bp就行，设计这种载体引物不用考虑那么多，设计出来试就可以了。另外载体引物一般不会像你说的在两侧设计…… 发自小木虫IOS客户端 |
23楼2017-10-13 22:25:25
didongwei
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这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位点，或者保护碱基换成G或C 发自小木虫IOS客户端 |
28楼2017-10-14 22:55:32
didongwei
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