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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 设计引物遇到难题
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-10-13 12:03:53
随便帮你选了一段序列，具体可以参照NCBI上的在线软件
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi?ctg_time=1507856996&job_key=09kMhZmNlCWzG5EenH61LOZlpB7Ldr8Dyg

大.png
...

大神，请问在ncbi在线设计引物还需要验证吗？还是可以直接用？
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21楼2017-10-13 20:56:13
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mlxmiao

木虫 (著名写手)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 20:56:13
大神，请问在ncbi在线设计引物还需要验证吗？还是可以直接用？...

我不验证，如果认为不保险，可以多设计几对引物

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22楼2017-10-13 21:33:33
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
20楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-13 20:01:16
如果我要用酶切法。然后引物设计在起始密码子和终止密码子两侧，这样可以吗/，因为设计在两侧的引物条件貌似比在起始、终止密码子上设计的引物好一点...

如果用酶切法做，还要加酶切位点和保护碱基，设计好后单条引物长度不要大于35bp就行，设计这种载体引物不用考虑那么多，设计出来试就可以了。另外载体引物一般不会像你说的在两侧设计……

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不是优秀，而是不可替代
23楼2017-10-13 22:25:25
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
23楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-13 22:25:25
如果用酶切法做，还要加酶切位点和保护碱基，设计好后单条引物长度不要大于35bp就行，设计这种载体引物不用考虑那么多，设计出来试就可以了。另外载体引物一般不会像你说的在两侧设计……
...

那么设计出来后两者的Tm值相差太大的话，PCR中的温度应该如何设置呢？

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24楼2017-10-14 09:00:11
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-10-13 21:33:33
我不验证，如果认为不保险，可以多设计几对引物
...

那大神设计完后会将引物放入pp5或者oligo进去看看结果吗？因为我在oligo6中设计好一个引物没有出现任何错误，但是放入pp5中就有出现错误。这有参考价值吗？

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25楼2017-10-14 09:03:16
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-10-13 21:33:33
我不验证，如果认为不保险，可以多设计几对引物
...

那大神设计完后会将引物放入pp5或者oligo进去看看结果吗？因为我在oligo6中设计好一个引物没有出现任何错误，但是放入pp5中就有出现错误。这有参考价值吗？

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26楼2017-10-14 09:03:14
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
22楼: Originally posted by mlxmiao at 2017-10-13 21:33:33
我不验证，如果认为不保险，可以多设计几对引物
...

那大神设计完后会将引物放入pp5或者oligo进去看看结果吗？因为我在oligo6中设计好一个引物没有出现任何错误，但是放入pp5中就有出现错误。这有参考价值吗？

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27楼2017-10-14 09:03:14
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didongwei

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
24楼: Originally posted by 林小露 at 2017-10-14 09:00:11
那么设计出来后两者的Tm值相差太大的话，PCR中的温度应该如何设置呢？
...

这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位点，或者保护碱基换成G或C

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不是优秀，而是不可替代
28楼2017-10-14 22:55:32
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育种小飞

新虫 (初入文坛)
扩基因全长，分两种情况，如果是从质粒中扩，引物直接取起始密码子和终止密码子，如果从cDNA中扩，那就必须在utr区设计引物，

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29楼2017-10-15 15:09:56
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林小露

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
28楼: Originally posted by didongwei at 2017-10-14 22:55:32
这个要试，一般先以低的那个作参考，在其基础上降低1到2度，然后扩增，如果没有杂带就可以，如果有杂带就逐渐提高温度，直至没有杂带为止，如果温度调到扩增不出来，也还是没有合适温度就更换引物，主要是换酶切位 ...

我的原模版是提取mRNA反转得到的CDNA，也可以用这个方法的是吗？

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30楼2017-10-15 21:08:57
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