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目的蛋白将His tag包裹，蛋白不与镍柱结合？急求纯化蛋白的大神指点！ 已有2人参与
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| 如题，载体用peasy-E1，前段带6个His标签，因不挂柱，又在后端加6个His标签，测序正确，能够表达且跑蛋白胶表达量很高，酶活也有，就是过镍住时，结合不上去，目标蛋白在流穿的bunding buffer 中，分析是：His tag被包裹在目的蛋白里，如何解决这个问题？？？得不到高纯度的蛋白，实验被迫中止，急求过镍柱的高手指点！！！ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-08-07 17:42:01
感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-08-07 17:42:01
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（1）超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。 （2）样品或者是结合缓冲液不正确： 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA等）。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。 · （3）组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用8M脲，6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT 进行纯化。 （4）His标签丢失,策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。 Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可以利用Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子，具体应用实例请参考《Recombinant Protein Purification Handbook》。 |
6楼2017-08-06 23:39:25
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原核表达很多蛋白都会过量表达。蛋白短时间内大量表达而来不及正确折叠，你先把你现有的表达时间缩小一倍看看。如果还不能解决，你只能想办法把把结构打开，再重新折叠。对了，你的蛋白不挂柱，但能溶解吗？有没有沉淀啥的？ 发自小木虫Android客户端 |
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8楼2017-08-07 08:01:37
10楼2017-08-07 08:32:57
2楼2017-08-06 16:52:43
3楼2017-08-06 22:40:46
4楼2017-08-06 23:00:22
5楼2017-08-06 23:01:38
armigera
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7楼2017-08-07 06:08:00
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不好意思，上面说的把蛋白当成原核的来处理了。如果是原核表达，你可以参照一下，如果不是你就变性一下，再复性。实在不行你就重新构建到一个新载体中试试。 发自小木虫Android客户端 |
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9楼2017-08-07 08:09:59
