| 查看: 2107 | 回复: 17 | ||
[求助]
目的蛋白将His tag包裹，蛋白不与镍柱结合？急求纯化蛋白的大神指点！ 已有2人参与
|
||
| 如题，载体用peasy-E1，前段带6个His标签，因不挂柱，又在后端加6个His标签，测序正确，能够表达且跑蛋白胶表达量很高，酶活也有，就是过镍住时，结合不上去，目标蛋白在流穿的bunding buffer 中，分析是：His tag被包裹在目的蛋白里，如何解决这个问题？？？得不到高纯度的蛋白，实验被迫中止，急求过镍柱的高手指点！！！ |
回复此楼» 本帖已获得的红花（最新10朵）
周虫虫mini» 猜你喜欢
湖北师范大学招调剂啦
已经有9人回复
-
邵阳学院食品与化学工程学院硕士调剂
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有214人回复
-
天津商业大学 生物与医药课题组招生
已经有0人回复
-
生物化工学硕招收调剂
已经有0人回复
-
广东石油化工学院2026年硕士研究生需要多名生物，制药工程，食品专业的调剂生
已经有0人回复
-
化工申博
已经有3人回复
-
申博自荐
已经有2人回复
-
广西民族大学化学化工学院化学工程与技术学硕，材料化工专硕调剂名额充足！
已经有0人回复
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-08-07 17:42:01
感谢参与，应助指数 +1
阳光雨露118: 金币+50, ★★★很有帮助 2017-08-07 17:42:01
|
（1）超声的功率不对(太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放) 策略：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。 （2）样品或者是结合缓冲液不正确： 策略：检测pH 及样品和结合缓冲液的组成份（EDTA等）。确保在溶液 中鳌合剂或强还原剂的浓度及起始咪唑的浓度不是太高。 · （3）组氨酸的标签没有完全的暴露 策略：在变性条件下(用8M脲，6M盐酸胍,1%SDS)并加入1-2mMDTT 进行纯化。 （4）His标签丢失,策略1：WB或者anti-his的抗体检查His是否表达，上游构建，改变his-tag的位(C-terminal or N-terminal)，必要时增加his个数(常用6-10个)。策略2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。策略3：改变螯合的金属离子，寻找到最佳的结合金属离子。 Ni2+通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数(组氨酸)6 标记的重组蛋白质的首选金属离子，也是一般最常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用Ni2+。可以利用Hitrap IMACHP来筛选不同的金属离子，具体应用实例请参考《Recombinant Protein Purification Handbook》。 |
6楼2017-08-06 23:39:25
|
原核表达很多蛋白都会过量表达。蛋白短时间内大量表达而来不及正确折叠，你先把你现有的表达时间缩小一倍看看。如果还不能解决，你只能想办法把把结构打开，再重新折叠。对了，你的蛋白不挂柱，但能溶解吗？有没有沉淀啥的？ 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
8楼2017-08-07 08:01:37
10楼2017-08-07 08:32:57
2楼2017-08-06 16:52:43
3楼2017-08-06 22:40:46
4楼2017-08-06 23:00:22
5楼2017-08-06 23:01:38
armigera
金虫 (正式写手)
- 应助: 8 (幼儿园)
- 金币: 3429.6
- 散金: 15
- 红花: 20
- 帖子: 756
- 在线: 113.5小时
- 虫号: 1975949
- 注册: 2012-09-05
- 性别: GG
- 专业: 发育生物学
7楼2017-08-07 06:08:00
|
不好意思，上面说的把蛋白当成原核的来处理了。如果是原核表达，你可以参照一下，如果不是你就变性一下，再复性。实在不行你就重新构建到一个新载体中试试。 发自小木虫Android客户端 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
9楼2017-08-07 08:09:59
