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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体和目的基因连接不上啊，一学期了，求助
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谢大旭

新虫 (初入文坛)

[求助] 载体和目的基因连接不上啊，一学期了，求助 已有8人参与

载体4.4k，目的基因是易错pcr的产物1.4k，载体和目的基因都经过双酶切3个小时，然后胶回收，载体浓度10ng/微升，目的基因14ng/微升，之后按照物质的量比1:6进行连接，t4连接酶过夜，然后做转化，感受态是买的trans10，完全不长菌啊，求助

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MAS_rice

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1楼 2017-05-24 15:42:59
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伤何处

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我觉得首先你得确定载体和目的片段是否连接上。然后再确定是不是转化的问题（如果实验室其他人的转化没问题，你的应该也不会有问题）。
所以，连接完后 你可以取1-2ul的连接产物为模板，用载体上的引物做一轮PCR，看看是否扩增出你的目的片段。
如果有目的条带，说明你的片段已经连上载体了，连接反应没问题。如果感受态没问题，你再确认下抗性之类的有没有问题；
如果没有目的条带，说明没有连上，那你就换其他方法。推荐诺唯赞（Vazyme）的一步法试剂盒，效率高，便宜。
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对也罢，错也罢；正也罢，逆也罢；通途也好，崎岖无妨……但问，吾心坚否？若坚，纵使歧路，以铁心，贯穿而过，亦为大道！不坚，便是坦途，也难登临绝顶，观险峰
50楼2017-05-29 00:46:11
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-25 07:43:01
你的载体和目的基因的浓度也太低了，估计你吸两微升去电泳都没有条带

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
3楼2017-05-24 17:33:42
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幻影望晴

新虫 (初入文坛)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-27 07:37:52
做的同时，可以有一组实验直接用质粒转化感受态细胞看下转化活力，如果转化后菌落较少，也会影响你的连接片段转化效率，比较你的片段较长

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18楼2017-05-25 10:41:17
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FJie

新虫 (初入文坛)
嗯嗯，我也觉着两个浓度太低了

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4楼2017-05-24 17:47:37
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by FJie at 2017-05-24 17:47:37
嗯嗯，我也觉着两个浓度太低了

你们平时回收浓度多少呢

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6楼2017-05-24 18:06:49
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mlxmiao

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
用in-fusion吧。这个还可以

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9楼2017-05-24 22:15:47
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-05-25 07:43:24
引用回帖:
7楼: Originally posted by 谢大旭 at 2017-05-24 18:11:14
做连接载体和目的基因加多少ng呢
...

载体与片段比是0.02??载体大小bp 比0.06??片段大小bp。我一般不测浓度，而是通过电泳判断，1:2或者1:3的比例做。

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
10楼2017-05-24 23:22:17
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飞翔的吉大人

新虫 (初入文坛)
不加水，把你回收的片段全部加进去，载体有一点就可以

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17楼2017-05-25 10:39:42
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寰宇清

新虫 (小有名气)
用同源重组试试吧，

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19楼2017-05-25 11:23:38
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
建议尝试基于重组酶的连接。

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做一个阳光、开朗的小和尚
35楼2017-05-26 21:33:37
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普通回帖

谢大旭

新虫 (初入文坛)
求助

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2楼2017-05-24 16:43:18
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-05-24 17:33:42
你的载体和目的基因的浓度也太低了，估计你吸两微升去电泳都没有条带

跑胶还是有条带的，你们平时回收浓度多少呢？

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5楼2017-05-24 18:06:32
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by MAS_rice at 2017-05-24 17:33:42
你的载体和目的基因的浓度也太低了，估计你吸两微升去电泳都没有条带

做连接载体和目的基因加多少ng呢

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7楼2017-05-24 18:11:14
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
送红花一朵


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8楼2017-05-24 19:07:18
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