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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体和目的基因连接不上啊，一学期了，求助
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
29楼: Originally posted by sunlk at 2017-05-26 11:41:36
载体4.4x0.66x0.03=87ng；片段1.4x0.66x0.3=277ng；你就按照这样体系加，同时总体系要小，10ul最好，你的涂完不长菌说明俩问题：要么载体切的特别好，要么是你的感受态不行。如果是前者的话 你就按照这个体系加，绝 ...

谢谢，0.66和0.03是什么意思呢？

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31楼2017-05-26 15:28:34
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匿名

用户注销 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
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32楼2017-05-26 15:47:13
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
32楼: Originally posted by 谌文123 at 2017-05-26 15:47:13
感受态，连接酶是否在存在问题，可做对照检查一下。优化片段、载体的比例等，应该没问题的，祝好运！

谢谢

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33楼2017-05-26 17:41:02
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balalalabala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
想验证是不是浓度问题，用另外个相同位点的PCR直接柱回收的片段去连。基本判断应该不是浓度问题，分子实验确实很难找问题，我最近和楼主遇到相同的问题一个月了，很烦。
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34楼2017-05-26 21:17:52
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zhaozhibozhi

金虫 (正式写手)
建议尝试基于重组酶的连接。

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做一个阳光、开朗的小和尚
35楼2017-05-26 21:33:37
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再闹不给糖

新虫 (正式写手)
用ligation high这个连接酶试试，另换体系比例

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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过
36楼2017-05-26 21:36:42
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lucky_1000

新虫 (正式写手)
用In Fusion 效率高 还快

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37楼2017-05-26 22:39:32
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吃抹茶的喵

新虫 (初入文坛)
前提是你的感受态，载体，和目的基因都对。可以载体加2ul，目的基因加6ul，再加1ul酶，1ul buffer。16℃过夜。连接摇菌的时候加200ul培养基，180rpm，45min。涂板时把菌都涂了这样菌浓。如果板上就长了一两个菌落也别放弃！！这个也是有可能对的

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38楼2017-05-26 22:41:22
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huagnshaowu

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
39楼2017-05-26 23:10:26
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lemon201399

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by 54zhongling at 2017-05-25 14:12:47
目的基因直接纯化，不切胶，多挑些单克隆试试

请问pcr之后不切胶，怎么纯化啊，我也在做这个

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40楼2017-05-27 00:22:50
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