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谢大旭

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29楼: Originally posted by sunlk at 2017-05-26 11:41:36
载体4.4x0.66x0.03=87ng；片段1.4x0.66x0.3=277ng；你就按照这样体系加，同时总体系要小，10ul最好，你的涂完不长菌说明俩问题：要么载体切的特别好，要么是你的感受态不行。如果是前者的话你就按照这个体系加，绝 ...

谢谢，0.66和0.03是什么意思呢？

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31楼2017-05-26 15:28:34

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匿名

用户注销 (正式写手)

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32楼2017-05-26 15:47:13

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谢大旭

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32楼: Originally posted by 谌文123 at 2017-05-26 15:47:13
感受态，连接酶是否在存在问题，可做对照检查一下。优化片段、载体的比例等，应该没问题的，祝好运！

谢谢

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33楼2017-05-26 17:41:02

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balalalabala

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【答案】应助回帖

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想验证是不是浓度问题，用另外个相同位点的PCR直接柱回收的片段去连。基本判断应该不是浓度问题，分子实验确实很难找问题，我最近和楼主遇到相同的问题一个月了，很烦。

34楼2017-05-26 21:17:52

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zhaozhibozhi

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建议尝试基于重组酶的连接。

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做一个阳光、开朗的小和尚

35楼2017-05-26 21:33:37

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再闹不给糖

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用ligation high这个连接酶试试，另换体系比例

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天空没有留下翅膀的痕迹，我却从中飞过

36楼2017-05-26 21:36:42

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lucky_1000

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用In Fusion 效率高还快

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37楼2017-05-26 22:39:32

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吃抹茶的喵

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前提是你的感受态，载体，和目的基因都对。可以载体加2ul，目的基因加6ul，再加1ul酶，1ul buffer。16℃过夜。连接摇菌的时候加200ul培养基，180rpm，45min。涂板时把菌都涂了这样菌浓。如果板上就长了一两个菌落也别放弃！！这个也是有可能对的

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38楼2017-05-26 22:41:22

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huagnshaowu

禁虫 (正式写手)

本帖内容被屏蔽

39楼2017-05-26 23:10:26

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lemon201399

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20楼: Originally posted by 54zhongling at 2017-05-25 14:12:47
目的基因直接纯化，不切胶，多挑些单克隆试试

请问pcr之后不切胶，怎么纯化啊，我也在做这个

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40楼2017-05-27 00:22:50

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