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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体和目的基因连接不上啊，一学期了，求助
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by 飞翔的吉大人 at 2017-05-25 10:39:42
不加水，把你回收的片段全部加进去，载体有一点就可以

这么做过了，也是不行啊，载体3.2微升，目的基因4.8微升，还是不长

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21楼2017-05-25 15:00:58
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xinxiyuzhou at 2017-05-25 10:03:05
可以用pcr产物回收试剂盒回收酶切后的产物和载体，胶回收损失太大也要看一下你的酶能不能双切，浓度不是太大的问题，需不需要加BSA？连接的温度？

酶切加bas，连接温度是16度

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22楼2017-05-25 15:06:39
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laolaohutu

银虫 (正式写手)
载体片段和目的基因片段浓度太低，建议提高质粒的质量，扩大酶切体系
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请享受无法回避的痛苦
23楼2017-05-25 15:38:32
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
23楼: Originally posted by laolaohutu at 2017-05-25 15:38:32
载体片段和目的基因片段浓度太低，建议提高质粒的质量，扩大酶切体系

同实验室的，回收浓度也是这样，转化长也很多，应该不是浓度的问题

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24楼2017-05-25 15:44:51
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xinxiyuzhou

至尊木虫 (著名写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by 谢大旭 at 2017-05-25 15:06:39
酶切加bas，连接温度是16度
...

你那两个酶能不能双切呢？16度连接不用过夜，几个小时就够了，4度过夜。再重新做一下吧这个片段不算大，应该比较好做，实在不行，让做出来的人替你做一次，或者你们同时做一次，看看到底是什么原因

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25楼2017-05-25 17:18:55
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star013

新虫 (知名作家)
我们可以提供载体构建技术服务哈

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26楼2017-05-26 10:38:59
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
首先，酶切回收需要跑个凝胶检测，载体有没有切成线状，其次就是16度酶链过夜，10ul体系就好：T4连接酶1ul，buffer 1ul，载体和目的片段，自己定量，剩余加ddwater；酶链过夜之后，转化，感受态细胞最好是自己做的，一般买的不怎么好，毕竟感受台拿出-80后5min就得转入链接产物，所以，我建议你还是自己做感受台，很好做的。

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付出定有回报
27楼2017-05-26 11:09:42
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enjoy大志

铜虫 (小有名气)
我的载体是5.6kb，目的片段1.6kb，bamhi和ecori双切得。希望对你有帮助

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付出定有回报
28楼2017-05-26 11:10:58
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sunlk

铜虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体4.4x0.66x0.03=87ng；片段1.4x0.66x0.3=277ng；你就按照这样体系加，同时总体系要小，10ul最好，你的涂完不长菌说明俩问题：要么载体切的特别好，要么是你的感受态不行。如果是前者的话 你就按照这个体系加，绝对没问头。要确保你们的T4是好使的。
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很给力
29楼2017-05-26 11:41:36
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谢大旭

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
27楼: Originally posted by enjoy大志 at 2017-05-26 11:09:42
首先，酶切回收需要跑个凝胶检测，载体有没有切成线状，其次就是16度酶链过夜，10ul体系就好：T4连接酶1ul，buffer 1ul，载体和目的片段，自己定量，剩余加ddwater；酶链过夜之后，转化，感受态细胞最好是自己做的， ...

嗯嗯好的，谢谢

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30楼2017-05-26 15:27:43
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