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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量问题求助
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lemon201399

新虫 (初入文坛)

[求助] 荧光定量问题求助 已有1人参与

做荧光定量，可是内参数值比18低而且不稳定，用的内参是gadph,我的模板已经稀释到了200ng每微升，不知道是什么原因，已经心灰意冷！求指点！！

荧光定量问题求助


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1楼 2017-03-31 10:17:20
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曙光karry

新虫 (初入文坛)
你的模板是质粒吗？多大的？如果是质粒的话200ng太多了

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2楼2017-03-31 21:22:16
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lemon201399

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 曙光karry at 2017-03-31 21:22:16
你的模板是质粒吗？多大的？如果是质粒的话200ng太多了

不是质粒，是cdna呢

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3楼2017-03-31 23:30:53
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qqloving

铁虫 (著名写手)
cdna

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4楼2017-04-01 00:03:26
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qqloving

铁虫 (著名写手)
模板cdna含量太高了

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5楼2017-04-01 00:03:56
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先更正一个问题，你的所谓200ng，指的是初始投入Total RNA的量，而不是cDNA，TotalRNA中，mRNA含量仅为1%左右，所以你做完RT以后，cDNA的量也只有几ng，这还要取决于你的RNA质量好坏。
第二，内参CT小于18说明模板浓度太大，按照2μg TotalRNA逆转录20μl体系，可稀释至200μl备用，投入量2μl，即：每样品投入量2000ng/200μl*2=20ng（按totalRNA投入量计算）。
第三，不稳定，说明你的操作有问题，SD应小于0.5。先确定加样的时候，样品是否充分混匀，包括Q-PCR Mix和模板cDNA，若都混匀了，就说明你的加样量重复性不好，没能保证每个重复的上样量一致。这个多练练就好了。
以上，应该能解决你的问题
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6楼2017-04-01 09:49:09
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