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荧光定量问题求助 已有1人参与
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做荧光定量，可是内参数值比18低而且不稳定，用的内参是gadph,我的模板已经稀释到了200ng每微升，不知道是什么原因，已经心灰意冷！求指点！！ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2017-03-31 21:22:16
3楼2017-03-31 23:30:53
qqloving
主管区长
- 应助: 3 (幼儿园)
- 金币: 4039.3
- 散金: 625
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- 在线: 90.1小时
- 虫号: 1720447
- 注册: 2012-03-27
- 专业: 生物信息学
4楼2017-04-01 00:03:26
qqloving
管理员
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- 专业: 生物信息学
5楼2017-04-01 00:03:56
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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首先更正一个问题，你的所谓200ng，指的是初始投入Total RNA的量，而不是cDNA，TotalRNA中，mRNA含量仅为1%左右，所以你做完RT以后，cDNA的量也只有几ng，这还要取决于你的RNA质量好坏。 第二，内参CT小于18说明模板浓度太大，按照2μg TotalRNA逆转录20μl体系，可稀释至200μl备用，投入量2μl，即：每样品投入量2000ng/200μl*2=20ng（按totalRNA投入量计算）。 第三，不稳定，说明你的操作有问题，SD应小于0.5。先确定加样的时候，样品是否充分混匀，包括Q-PCR Mix和模板cDNA，若都混匀了，就说明你的加样量重复性不好，没能保证每个重复的上样量一致。这个多练练就好了。 以上，应该能解决你的问题  |
6楼2017-04-01 09:49:09
120