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无知顽童

新虫 (初入文坛)

[求助] Kpn1和xba1酶切链接 已有3人参与

我用含有kpn1和xba1的引物扩的PCR，然后做酶切（和载体PCDNA3.1一起），然后做链接转化，为什么连出来的有些质粒要么和空载一样大要么比我空载体还小？有没有可能是xba1甲基化的问题啊？？求各位大神指点。一下是我引物：
CTGTGGGTACC[KpnⅠ]TGACATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG
CTGTCGTCTAGA[XbaⅠ]GCACTAAGCGTAGTCTGGAACGTCGTATGGATA
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1楼 2017-03-28 15:18:38
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路人甲007

木虫 (正式写手)

小七

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-01 07:46:52
建议你用同源重组，比酶切连接好用的多
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与人玫瑰手有余香
2楼2017-03-28 22:19:01
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实XbaI还是很好用的
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3楼2017-03-31 09:09:55
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ken19860823

木虫 (正式写手)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-04-01 07:46:20
酶切连接假阳性还是有，双酶切的假阳性较少，推测你已经拿到阳性克隆。克隆方面有时候是会莫名其妙，但是只要不是特殊占多数都没问题。至于你的问题，应该是载体片段比目的片段摩尔比过高(1:3)。

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做基因修饰的老菜鸡
4楼2017-03-31 15:01:10
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mkq800

银虫 (小有名气)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-04-01 07:46:41
建议不要用PCR产物双酶切，可以试试将产物连接t载体之后再切下来，连目的载体，另外一楼的方法不错，同源重组更高效。

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5楼2017-04-01 00:17:59
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

PCR产物直接酶切一般没问题。根据你的描述，既然有空载，说明你的酶切不够充分（双酶切一般不会自连），或者你的质粒酶切产物没纯化，导致切开的小片段跟载体又连回去了。建议将PCR、质粒双酶切产物纯化回收，定量后按照3:1投入量做链接，没啥问题的。
至于比空载小的片段，算是正常，质粒电泳本来就可能有3条带，超螺旋状态跑的最快，比线性快，质粒提的好的话就只有超螺旋的带了。
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6楼2017-04-01 10:02:46
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