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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于His-Tag的一些疑问
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胖妞光芒万丈

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于His-Tag的一些疑问 已有2人参与

食品方向，涉及分子生物学，求助各位大神。
1.将编码酶的基因插入质粒，为了便于后期的蛋白分离纯化，需要插入HIS-TAG，据说要在标签之后再插入一小段无关的序列，想问下插入的这段碱基序列有标准吗？
2.目的基因与标签之间要设置酶切位点，目的是什么呀？酶切位点不是切基因的吗，但是标签的6个组氨酸不是要翻译出来跟目的蛋白一起分离纯化吗？
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1楼 2017-02-23 09:44:31
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bush119

木虫 (职业作家)

灌水高手

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-02-24 08:45:37
胖妞光芒万丈: 金币+2, ★有帮助 2017-03-09 14:38:36
目的基因与标签之间要设置酶切位点。。。
我觉得不科学 也可能是没理解楼主用意
设计正确的话 你的终止密码在哪里就翻译到哪里 加入酶切位点 翻译表达出来有何意义
有在标签和目的蛋白之间加入连接肽的情况 但是你这个His标签这么小完全没必要
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2楼2017-02-23 10:56:05
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2017-02-24 08:46:48
胖妞光芒万丈: 金币+2, ★有帮助 2017-03-09 14:39:11
His标签的纯化效果不是太好，有时候加蛋白酶切位点，在蛋白挂柱后酶切下来。
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3楼2017-02-23 14:40:46
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mr.clutch

新虫 (小有名气)
★ ★
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2017-02-24 08:46:16
1.无关序列指的是在标签和目的蛋白之间的一个linker，一般长度为10~15个氨基酸，且为疏水性氨基酸，目的是为了防止标签被目的蛋白包裹而不利于纯化.  2.酶切位点是为了在纯化之后切除标签，从而排除标签对后期实验的影响

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4楼2017-02-23 17:41:14
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胖妞光芒万丈

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mr.clutch at 2017-02-23 17:41:14
1.无关序列指的是在标签和目的蛋白之间的一个linker，一般长度为10~15个氨基酸，且为疏水性氨基酸，目的是为了防止标签被目的蛋白包裹而不利于纯化.  2.酶切位点是为了在纯化之后切除标签，从而排除标签对后期实验的 ...

想问一下那个linker是有标准吗？还是自己设置呀。谢谢
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5楼2017-02-23 21:47:41
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ULYSSEESWB

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by mr.clutch at 2017-02-23 17:41:14
1.无关序列指的是在标签和目的蛋白之间的一个linker，一般长度为10~15个氨基酸，且为疏水性氨基酸，目的是为了防止标签被目的蛋白包裹而不利于纯化.  2.酶切位点是为了在纯化之后切除标签，从而排除标签对后期实验的 ...

加入疏水linker岂不是更要被包裹进蛋白内部，通常为了使his tag充分暴露都是变性蛋白上柱
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6楼2017-02-24 11:06:06
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elabscience

新虫 (小有名气)
目的基因与标签之间要设置酶切位点。。
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专注科学研究
7楼2017-02-26 16:06:04
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hanysimida

新虫 (小有名气)
我们做了一个蛋白，也是加his tag，就直接加了而已，没添加其他序列

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8楼2017-02-26 17:31:24
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mr.clutch

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 胖妞光芒万丈 at 2017-02-23 21:47:41
想问一下那个linker是有标准吗？还是自己设置呀。谢谢...

sorry，不应该笼统的说是疏水氨基酸，比较普遍的是（G4S）n linker，G4S 为4个甘氨酸1个氨酸，具体你可以参阅网上资料。另外，不好意思这么久才回复，还没有养成天天关注小木虫的习惯

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9楼2017-03-10 15:36:50
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mr.clutch

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by ULYSSEESWB at 2017-02-24 11:06:06
加入疏水linker岂不是更要被包裹进蛋白内部，通常为了使his tag充分暴露都是变性蛋白上柱...

确实不应该笼统的说是疏水氨基酸；变性上柱的话，如果要求蛋白活性的话，复性也头疼啊

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10楼2017-03-10 15:39:48
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